细胞疗法治疗关节软骨再生的方法

关节软骨是人体众多关节中常见的软骨类型。然而，软骨的再生能力有限。人们已经采用了一系列方法来帮助45岁以下患有软骨缺陷的成年人，但骨关节炎等其他软骨病理仅限于非甾体抗炎药和全关节置换术。

细胞疗法和合成生物学不仅可用于治疗软骨缺陷，而且有潜力成为一种治疗方法促进软骨再生并可能逆转骨关节炎。细胞修复骨关节炎软骨的潜力，以及利用合成生物学进行基因工程细胞干细胞方法，重点是自体软骨细胞植入和基质自体软骨细胞植入。然后，我们将讨论细胞疗法。在这篇综述中，我们将介绍当前细胞疗法治疗软骨缺损再生的方法。

软骨再生细胞疗法

微骨折和嫁接：当前的黄金标准

微骨折 (MF) 也称为骨髓刺激，用于小于2cm的软骨缺损。在此过程中，软骨下骨的一小部分被穿透，从而在骨髓和软骨之间形成导管。在有缺陷的软骨下方的骨头上钻一些小孔，以刺激骨髓，如所示图1。骨髓中的干细胞有助于软骨再生和缺损区域的愈合。 然而，MF更注重纤维软骨的修复，而不是透明软骨的实际再生。接受MF的患者在手术24个月后表现出关节功能下降。还有人担心MF不会延迟OA的最终发病。

总体而言，MF 后软骨的质量和修复是可变且不一致的，这被认为与有限的低数量干细胞 细胞 在刺激后侵入受损区域。由于缺乏标准化和对患者的临床随访，很难追踪 MF 修复的成功率并比较不同的临床结果。

图1：FDA批准并实施的软骨缺损再生疗法示意图总结。微骨折和自体移植等治疗方法是当前软骨缺损修复的黄金标准。 ACI和MACI已获得FDA批准，可用于大面积缺损修复。

其他金标准治疗方法包括使用骨软骨移植修复较大（>2平方厘米）的病变。自体移植物是从关节中承载力较小的部位取出的骨软骨组织，然后移植到病变部位。通过用健康组织对患者的缺损进行物理填充，希望该组织能与受损部位融合，从而修复缺损。

大量临床研究表明，骨软骨自体移植物对术后10年后的缺损修复有很好的疗效，据报道，这种方法的优点是移植物能迅速融入缺损部位。从生理学角度看，膝关节机械压力最低的部位位于股骨外侧蹄弓或股骨切迹处，也是大多数骨栓的来源部位。为了降低供体部位的发病率，人们采用了一种被称为镶嵌成形术的替代技术，即从部分健康软骨组织中提取多个小的塞子，然后将其放置在中小型缺损部位。使用患者自身组织并进一步损伤膝关节的效果并不理想，因此有必要采用其他策略进行缺损修复。图1：描述了目前修复软骨缺损的治疗方法。

自体移植物的其他替代方案是骨软骨同种异体移植物，通常在死亡后24小时内从年轻捐赠者身上采集，但保质期较短，为28天，并且存在免疫原性问题。尽管如此，虽然这些治疗方法已在临床上取得成功，但组织工程和再生医学领域的目标是设计软骨再生方法以克服这些限制。在过去的二十年里，人们对使用异种移植物修复骨软骨缺损进行了更多的研究。这里，来自猪膝盖等动物的骨软骨栓经过脱细胞处理，并在临床前和临床研究中显示出功效，如图2。

图2.目前正在进行软骨缺损再生临床试验的疗法示意图。植入式疗法例如脱细胞支架和细胞片层技术被用于促进软骨再生并填充缺损。此外，来自脂肪组织的MSC分泌组和基质血管部分已被关节内注射到膝盖中，希望这些 细胞的分泌组能够产生在治疗效果上。还研究了脱细胞ECM与基质血管成分相结合等治疗方法的组合。

最近的研究使用分化的干细胞 细胞形成软骨ECM，将其去细胞化并整合天然软骨细胞进入脱细胞支架。人们注意到，与糖原合成酶激酶3β (GSK3β) 途径相关的脱细胞基质具有促软骨形成作用，这对于调节细胞差异化。此外，这项研究证明了诱导多能干细胞，无论细胞来源如何，脱细胞ECM已成为用于软骨组织工程的更普遍的天然基质，并显示出作为细胞的巨大潜力-免费治疗性，也在图2。在下一节中，我们将重点讨论无支架和基于基质软骨细胞的软骨修复疗法。

软骨细胞疗法：聚焦自体软骨细胞植入

在过去的二十年中，更多的研究涉及注射自体软骨细胞以促进患者缺损处的软骨再生。这称为自体软骨细胞植入（ACI）。ACI是一种解决软骨缺陷（通常大于 2 cm）的两步方法²。该程序的第一步是从膝盖非承重部分的健康软骨样本中分离软骨细胞。这些软骨细胞随后以单层形式扩增并注射回患者的缺损处。第一代技术使用骨膜补片将软骨细胞悬浮液隔离到缺损区域。然而，软骨细胞肥大、再手术和清创率高等问题使得第二代ACI成为必要。

新一代的补片材料从骨膜补片转变为I型和III型猪胶原膜。这种方法仍然需要对缺损处进行膜缝合，并导致一些悬浮液泄漏，但事实证明它确实更有效。

ACI后的组织成熟分为四个阶段：植入阶段（植入后0-6周）、过渡和增殖阶段（6-12周）、早期阶段成熟阶段（12-26周）和晚熟阶段（26周-3年）。在植入阶段，软骨细胞开始迁移到缺损处，然后在过渡和增殖阶段填充缺损并形成软软骨。早期成熟被认为是软骨细胞开始产生II型胶原和聚集蛋白聚糖从原始软骨转变为更坚固的软骨的时间点。最后，在成熟后期，新组织填充了缺损区域，软骨达到透明状态。

尽管设备存在一些局限性，但ACI是一种治疗软骨损伤的有效方法，并且具有通过使用患者自身细胞而缺乏免疫原性等优点细胞。软骨细胞渗漏和整体融入软骨促进了进一步的改善。第三代 ACI 技术采用了称为基质辅助自体软骨细胞植入 (MACI) 的基质支架，增强软骨细胞活力并模仿软骨的机械特性。有关MACI的更多详细信息将在下一节中讨论。

软骨细胞疗法：基质辅助自体软骨细胞植入

MACI是目前最常见的治疗软骨缺损的细胞疗法方法之一，已获得批准2016年获得FDA批准。从患者软骨中分离软骨细胞，进行扩增，然后接种到由猪胶原蛋白膜组成的3D基质上。这种成熟的医疗设备结合了基质和细胞，可增强软骨再生以填充软骨缺陷。

由于软骨细胞在整个膝盖中的可用性有限，因此该装置背后的想法是促进软骨细胞整合回天然软骨，从而填补缺陷。 MACI适用于从单一到多重症状缺陷的一系列软骨缺陷。膝关节常见的软骨缺损包括：股骨外侧髁、股骨内侧髁有或没有骨损伤、髌骨和滑车缺损。

软骨细胞疗法：细胞片

组织工程学的进步改变了MACI等方法，也改变了细胞片技术等新方法。为形成细胞片，可在热敏组织培养器皿上培养细胞，并通过降低培养温度移除细胞。细胞片培养的常见方法包括将细胞片组合在一起。例如，高桥（Takahashi）等人将三张软骨细胞片扩大并组合在一起，再培养7天，就形成了用于植入的分层细胞片。此外，关于肿瘤致病性的研究以及对基因突变和染色体异常出现的监测，使细胞片技术得以在日本的临床试验中应用。

在临床方面，Sato等人进行的一项研究利用传统手术干预治疗膝关节OA，随后进行自体软骨细胞片移植以促进软骨修复。该研究使用了八名患者的队列，通过关节镜活检监测术后12个月的治疗效果。对患者活检组织进行了组织学分析，并通过基因表达分析对细胞片进行了评估，以预测其临床疗效。图像显示，缺损区域的软骨再生，膝关节排列保持一致。这项研究的结果支持了自体软骨细胞片具有支持人体膝关节缺损部位透明样软骨再生的潜力这一观点。

为了克服自体软骨的局限性，利用干细胞来生成软骨已变得越来越普遍软骨细胞扩张。在下一节中，我们将进一步扩展不同的干细胞疗法用于软骨修复。

干细胞疗法

干细胞是一种常见且丰富的细胞类型用于多种器官和病理的细胞疗法。在本节中，我们将讨论干细胞疗法的用途软骨缺陷并研究OA中的干细胞疗法。

除患者自身骨髓来源的干细胞外，其他干细胞来源正在被研究作为一种细胞疗法用于软骨再生。值得注意的是，表格1描述了不同的细胞来源及其对软骨再生的优点和局限性。在本节中，我们将讨论间充质基质细胞 (MSC)、MSC 分泌组和iPSC。

间充质干细胞

间充质干细胞可以很容易地来源于脐带、骨髓、脂肪组织，并且具有自我更新和分化成多种组织的能力。更重要的是，间充质干细胞具有分化为软骨细胞和骨的多潜能，因此可用于软骨和骨软骨缺损。具体而言，骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）在与营养因子（如转化生长因子-β3（TGF- β3））配伍后，显示出关节软骨再生的潜力。其他研究发现，间充质干细胞在体外扩增过程中有助于软骨细胞的表型维持，这表明间充质干细胞和软骨细胞的共培养可能是自体软骨细胞植入的一种新方法。

临床研究显示，在OA患者的关节内注射骨髓间充质干细胞可改善软骨状况，且无严重影响。Muthu等人进行了一项荟萃分析，调查了目前文献中的随机对照试验，以评估用于治疗OA的间充质干细胞的最有效范围。由于临床试验缺乏标准化，干细胞治疗骨关节炎的疗效结果各不相同。建议进行剂量递增临床试验，以更好地规范干细胞在治疗OA中的应用。

虽然间充质干细胞具有作为软骨再生细胞源的潜力，但它们也分泌细胞因子、趋化因子和细胞外囊泡等旁分泌因子，这些因子被认为也能促进愈合和再生。大量蛋白质组学研究表明，间充质干细胞分泌50-100纳米的细胞外囊泡，即外泌体，可对受损组织产生治疗作用。

张等人的一项研究分离了人胚胎间充质干细胞衍生的外泌体，每周对大鼠骨软骨缺损进行关节内注射。结果表明，外泌体治疗12周后，与PBS对照组形成的纤维组织相比，缺损部位的软骨和软骨下骨完全恢复，并具有透明样特征。

总的来说，这些研究表明MSC分泌组具有促进体内软骨再生的潜力体内然而，在应用于临床之前，还需要开展更多工作来充分了解MSC分泌组促进再生的机制。

诱导多能干细胞

与胚胎干细胞的多能性相似，iPSCs也是由山中伸弥（Shinya Yamanaka）首先证明的经过去分化过程的体细胞产生的。iPSCs的来源包括血液和成纤维细胞，其中分离出的细胞经慢病毒改变后可表达常见的胚胎标志物，如八聚体结合转录因子4（Oct4）、SRY-box2（Sox2）、克鲁珀类因子4（Klf4）和c-myc。如前所述，与间充质干细胞的多能性相比，iPSCs具有多能性，这意味着iPSCs可以分化成任何主要生殖层：外胚层、中胚层和内胚层。这些细胞具有很高的自我更新潜能，使其成为透明软骨的理想细胞来源。由于软骨组织属于中胚层，iPSCs可首先分化为间充质祖细胞（iMPCs），然后再分化为软骨。

中村（Nakamura）等人进行的一项研究使用了iPSC衍生的神经嵴细胞，并将其诱导到类似间充质干细胞的状态。细胞分化后形成球体，用于生物打印。虽然这些方法尚未应用于临床，但人们正在利用iPSCs进行软骨缺损再生的进一步研究。iPSCs可应用于个性化医疗，因为它们可以来自患者本身，从而限制了免疫反应。然而，在临床应用之前，必须了解iPSC分化为软骨细胞的复杂性，以避免伦理问题。

了解OA和先前存在的关节疾病的多个方面对于基于患者的治疗开发是必要的。此外，了解患者OA的原因，如机械关节衰竭、炎症应激和代谢应激，可以为这些患者阐明最佳治疗方法。对软骨再生的再生级联缺乏了解导致治疗方法不一致，从而导致结果不一致。有人建议，为了减轻这些结果，未来的试验应该测试具体的假设，并重点关注对软骨生物学和再生的机制理解，以便为治疗的开发提供有价值的信息。

未来方向：合成生物学在软骨再生方面的潜力

在癌症等其他疾病状态下，细胞已利用合成生物学积极改造以靶向特定受体。例如，嵌合抗原受体T细胞（CART 细胞）已被设计用于靶向肿瘤相关抗原受体。 就与OA相关的人口老龄化而言，存在i) 缺乏软骨细胞再生潜力和ii) 称为衰老的细胞周期停滞的常见发作，这会导致慢性低-通过衰老相关分泌表型（SASP）的出现来确定炎症的分级状态。可以采用合成应用来增加软骨细胞的再生潜力，并通过合成遗传网络创建治疗过程，本质上是创建“工程软骨细胞”，如图3所示了。

图3：用于软骨修复的多种细胞疗法。该示意图描绘了多种细胞类型及其在软骨缺损修复中的用途。在这里，我们从ACI和MACI中看到的自体软骨细胞开始。然后我们转向干细胞，主要是MSC和iPsc，它们可以分化为软骨细胞并用于IA注射和基质。细胞疗法的未来主要集中在用于软骨再生的合成工程软骨细胞或干细胞衍生的软骨细胞。

结论

在这篇综述中，我们讨论了目前软骨再生的临床方法，主要针对45岁以下的患者。自体软骨细胞移植和基质自体软骨细胞移植已证明在软骨缺损方面取得了成功，但适合该手术的患者范围有限。此外，目前还没有任何DMOAD获得FDA批准，针对骨关节炎患者的干细胞疗法仍处于早期临床试验阶段。

了解先前存在的关节病理学的影响对于开发治疗方法是必要的。 间充质干细胞和诱导多能干细胞是软骨再生的无限细胞来源，但也有其自身的局限性，例如成本、伦理和表型挑战。采用合成生物学技术来增强软骨再生可能有助于解决骨关节炎缺乏有前景的细胞疗法的问题。

参考资料：Meagan J. Makarczyk (2023) Cell Therapy Approaches for Articular Cartilage Regeneration, Organogenesis, 19:1, DOI: 10.1080/15476278.2023.2278235

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