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支持生物疗法治疗卵巢早衰:证据是什么?

卵巢早衰(POI)是一种影响育龄妇女的多因素疾病。该疾病的特点是40岁之前卵巢功能丧失,并且已确定多种因素与其发病机制有关。但值得注意的是,至少50%的女性在发生卵巢功能不全后,卵巢中仍有剩余卵泡。

人口数据显示,全世界大约有高达3.7%的女性患有POI和随后的不孕症。目前,POI相关不孕症的治疗涉及卵母细胞捐赠。然而,许多患有POI的女性希望用自己的卵子受孕。目前的综述重点关注可用于治疗POI女性不孕症的新型生物学策略,旨在根据临床和临床前研究的证据,探讨其疗效是否优于传统治疗。这些实验方案包括:(i) 富血小板血浆 (PRP)、(ii) 外泌体疗法、(iii) 体外激活 (IVA)、 (iv) 干细胞疗法,(iv) microRNA 和 (v) 线粒体靶向疗法。

支持生物疗法治疗卵巢早衰:证据是什么?

无细胞疗法

富血小板血浆 (PRP)

富血小板血浆 (PRP) 是一种自体血液衍生物,与外周血相比,含有更高浓度的血小板 (PLT)(3至5倍)。PRP的生长因子 (GF)(>800种)浓度比外周血高5至10倍。事实上,PRP的作用并不具体,但支持所应用的每个组织的需要。

由于这种适应能力,PRP已越来越多地应用于各种临床环境,包括牙科、运动医学、皮肤病学/美容学、眼科、神经病学以及生殖医学。上述作用通过诱导细胞迁移、趋化性、血管生成、保持增殖与凋亡之间的平衡以及控制炎症和氧化应激来支持。这些因子主要分为趋化因子、丝裂原和抗原,在各种激动剂激活PRP后释放,并以旁分泌方式发挥作用,介导组织再生和稳态。

在过去的四年中,对患有卵巢功能不全的妇女进行的少数临床研究得出的新数据证明了PRP在卵巢再生方面的功效。特别是,在队列研究中,22%-60%的妇女通过卵巢内注射PRP恢复了月经周期;在病例报告或病例系列研究中,高达100%的妇女通过卵巢内注射PRP恢复了月经周期,并诱导自发排卵。这些作用伴随着雌二醇(E2)的增加和黄体生成素(LH)水平的降低。除激素恢复外,PRP似乎还能改善卵巢储备参数,如AMH和AFC;这也反映在促卵泡激素(FSH)水平的下降上

在妊娠结局方面,两项队列研究显示,PRP可将自然受孕率提高到7.4%-10%;然而,另一项研究报告的自然受孕率为0%。重要的是,PRP诱导的AFC增高可在卵巢刺激后成功取回卵母细胞,使体外受精(IVF)过程得以进行。根据对311名妇女进行的唯一一项相关的前瞻性队列研究,在胚胎移植(ET)后,26.4%的妇女有可能形成胚胎,22.8%的妇女有可能怀孕。最后但并非最不重要的一点是,在两项队列研究中,活产率(LBR)介于69%-100%之间,其中一项研究中自然受孕与试管婴儿受孕之间没有差异;但需要强调的是,两项研究中实际怀孕的人数都很少(分别为36人和3人),尤其是活产率为100%的研究(表1)。

富含血小板血浆 (PRP)
研究研究设计N主题干预措施跟进结果
Sfakianoudis 等人(2018)(27案例
报告
140 y,POI诊断时的年龄=35y,放弃HRT4m,闭经PRP(RegenACR-C试剂盒,浓度9 × 105/μl,双侧4ml,TV、超声引导髓内、多焦点)。
随后是自然周期IVF-ICSI
不适用6周恢复月经,↓ FSH,↑AMH,
生化妊娠导致5周自然流产
Pantos 等人。 (2019)(26案例
系列
227&40 y,闭经 > 1y,之前 IVF 失败,未接受 HRTPRP(双侧4ml,电视,超声引导,髓内,多灶)
邀请自然受孕
不适用月经恢复,
↓ FSH、LH
↑ AMH、AFC,
2年后临床妊娠; 4M。
卡基罗格鲁等人(2020)(29前瞻性队列研究311POI (ESHRE2016),24–40y,不孕史 >1yPRP(T-Biotechnology Laboratory 试剂盒,布尔萨,土耳其,2–4 ml,TV,US 引导,在皮质下和间质区域,至少在一个卵巢),月经结束后10 天内或随机.
2 m 允许自然受孕。然后,如果未怀孕但 AFC ≥1:COS + IVF ± 东部时间
1年↑ 亚足联& AMH (d2–4)、↔ FSH、
7.4%自然受孕,
64.8%接受过体外受精,26.4%活产/持续着床(69%的自然妊娠和IVF妊娠)8%冷冻胚胎,在ET后实现妊娠(每个ET 22.8%) , 8%发育出胚胎,4%
许等人。 (2020)(28案例
报告
137岁,6m闭经,之前POR至Gn,要求停止HRT2mGC 激活的 PRP (5 ml) +Gn(1 ml 由 150iu FSH +75iu LH 组成),每个卵巢 3 ml,在 TVUS 引导下注入卵巢基质  COS(间歇性阴道给药) + ICSI不适用↓FSH,自然排卵,月经恢复,卵母细胞产量=6,胚胎=3,双胎妊娠,早产(30w),无记录异常
Sfakianoudis 等人(2020)(24前瞻性、队列、试点研究30POI (ESHRE 2016)表现为闭经,<40y,HRT中断6mCG激活PRP(RegenACR-C试剂盒,浓度1 × 106
邀请自然受孕/μl,4 ml,双侧、多灶),随机时间。
1年3m随访时:月经恢复 60%,↓FSH、LH&↑ AMH、E2、AFC(第 3天或PRP后每月)
10%的自然妊娠和活产
Aflatoonian 等人(2021)(25前瞻性队列研究9POI (ESHRE 2016)a
PRP 前后 1 个月停止 HRT
GC 激活的 PRP(Rooyagen,德黑兰,伊朗,浓度比基础血样高 3-5 倍,1.5 ml,多灶,每个卵巢髓内) + 如果没有怀孕,则在 3 m 后第 10 天或随机注射第 2 次注射(3 ml)。邀请自然受孕1年月经恢复22%(第二次 PRP 注射后),
荷尔蒙没有恢复(2 m内),
0%自然妊娠
体外激活(IVA)
川村等人。 (2013) (30) &铃木等人。 (2015) (13)前瞻性队列研究37POI: < 40y,闭经>4 m,FSH>35 iu/L(初始标准:闭经>15 iu/L) 1年,FSH > 40 iu/L)
平均年龄 =< /span> 37 岁
腹腔镜卵巢切除术。将卵巢皮质切成条用于玻璃化冷冻。对一些碎片进行了组织学检查。升温后,将条带切成更小的立方体并用 Akt 刺激器培养 2  天。然后,将卵巢块移植到输卵管浆膜下方。然后进行卵巢刺激(雌激素预处理, ± 对照)。取卵后进行ICSI(Kawamura方案)1年根据组织学结果,54%存在残留卵泡,
从6名患者中取出24 个卵母细胞,
3次妊娠,2次活产
Zhai等人。 (2016) (31)前瞻性队列研究14POI: < 40年,闭经≥1年,FSH >< a i=4>35 iu/L 至少 2 次,间隔 4 周,E2<20pg/ml之前有 Gn 刺激后卵泡发育的证据   Kawamura 方案使用新鲜卵巢组织代替冻融组织。当卵泡达到排卵前阶段时,开始 hCG 治疗。1年根据组织学结果,50% 存在残余卵泡,
6 名患者显示 15 个卵泡发育波达到排卵前阶段,
4 名患者获得成功的卵母细胞检索和发育胚胎,
1 怀孕和发育活产,
3 个冷冻胚胎
法布雷格等人(2018)(32案例报告1POI、32y、FSH = 89.9 iu/L、AMH =< a i=4>0.02 ng/ml,干预前1天停止HRT 卵巢皮质的切除和自体移植是在同一手术中通过腹腔镜进行的。将卵巢碎片移植到对侧卵巢和靠近卵巢的腹膜袋中。手术后立即开始 GnRH 激动剂和 HMG 注射。不适用取出2个卵母细胞,形成2个胚胎,妊娠(单胎)
干细胞(SC)移植
Edessy 等人。 (2014) (33)前瞻性队列研究10POI:26–33 y,FSH≥20 iu/L,正常核型自体骨髓间充质干细胞(来自髂嵴)腹腔镜移植到卵巢6米月经恢复 10%,
子宫内膜局部分泌变化 20%
这两个结果均与 OCT4 表达和 ESS ≥5 相关
陈等人。 (2018)(34案例报告1POI:38岁,闭经2年每月一次 MSC,持续 6 m(浓度 2 × 107/ml第一次,1 × 107/ ml 在随后的时间),IV不适用↑ 卵巢大小、子宫内膜厚度和子宫内膜血流(电视和经腹超声)
丁等人。 (2018)(35盲法、随机对照试验14个,分为2组
UC-MSCs组:6个
胶原蛋白/UC-MSCs组:8个
POI:18-39岁,闭经>1年,FSH≥40iu/L 2次,间隔4-6周,伴侣精子分析正常UC-MSCs组:同种异体UC-MSCs(浓度5 × 106TVUS引导,单侧卵巢内注射,最多移植4次HRT(B组)+/400 μl,胶原蛋白浓度5 mg/ml)610×胶原/UC-MSCs组:胶原蛋白/ UC-MSCs(同种异体,UC-MSCs浓度5HRT(A组) +/400 μl)
1年↑ E2, ↓ FSH(胶原蛋白/ UC-MSCs 组),
↑ 卵巢体积(UC-MSCs组),存在血流两组患者均在 3 m 时出现卵泡样结构活跃迹象(UC-MSCs组为 16.7%,胶原/UC-MSCs 组为62.5%)
14.3% 自然受孕(同等)组间)
Igboeli等人。 (2020)(36病例报告(正在进行临床试验的首例2例)2POI:病例1:36岁,闭经4年,FSH = 110 iu/L,
病例2:42岁,闭经,左侧卵巢切除,FSH = 155 iu/L
腹腔镜下将自体骨髓间充质干细胞(来自髂嵴)移植到右侧卵巢(4 ml) + 左侧卵巢4 ml生理盐水(对照) ,仅适用于情况 1)1年恢复月经(1年1次月经),
↑E2增加150%,改善更年期症状
↑卵巢体积增加50%(与对照卵巢)
Mashayekhi 等人。 (2021) (37)非随机临床试验,1 期9、分3组(根据ADSCs量)POI:20-39岁,2次FSH≥25 iu/L,间隔4周,闭经>1年自体ADSC(腹下脂肪垫)移植5 × 106 < a i=4>、10× 106 或 15单侧卵巢电视7例腹腔镜2例。610 × 1年主要结果:无 SE/并发症
次要结果:
44.4% 恢复月经,
↓ FSH <25 iu/L (44.4%),组间无差异,
↔ AFC、AMH
Zafardoust 等人。 (2023) (38)前瞻性队列研究15兴趣点自体男性间充质干细胞1年100% 改善更年期症状,
2.6% 恢复月经,
↑AFC、E2、↓FSH、LH、↔ AMH
表格1:检验生物疗法对POI女性效果的临床研究

外泌体(exos)疗法

外泌体 (exos) 是细胞外囊泡,主要由间充质干细胞 (MSC) 释放,大小范围为30nm至150nm。通过释放非编码RNA、mRNA、生长因子和蛋白质,exos通过调节增殖和凋亡,积极影响细胞通讯以及受体细胞的命运。并通过减少受孕时间来提高受孕率,以及预防卵泡闭锁,增加激素水平、AMH水平和卵泡数量被证明可以恢复发情周期和人多能干细胞-间充质干细胞( hiMSC),以及人胚胎干细胞(ESC)和脂肪组织来源的MSC(ADSC)、脐带MSC (UC-MSC)。

在POI啮齿动物模型中,给予来自各种人类MSC的外泌体,例如骨髓来源的MSC (BMSC)体外实验证明,干细胞外泌体疗法诱导卵巢年轻化的主要机制是在颗粒细胞水平,即颗粒细胞的质量。这与POI发病机制有关。特别是,增殖增加的同时细胞凋亡减少,这与磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B (PI3K/Akt) 的上调有关和B细胞淋巴瘤2 (Bcl2),同时SMAD下调和Bcl-2相关X蛋白 (Bax)信号通路。除了exos疗法对颗粒细胞的影响外,人UC-MSC移植后,卵巢组织纤维化减弱,卵泡膜细胞分化增强,两者都是通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路介导的。有助于卵巢功能的恢复。

总而言之,现有的研究数据令人鼓舞,许多作者和研究人员现在认识到exos治疗是POI的潜在治疗方法。由于缺乏致瘤性、低免疫原性且无伦理问题,Exos被认为比干细胞 (SC) 潜在更安全。然而,为了考虑用于POI患者,需要在人体临床试验中评估其疗效和安全性。

体外激活(IVA)

正常Pfs和休眠Pfs的Pfs激活机制主要是在动物模型中进行研究的。目前仅有两项基于人体细胞的研究。所报道的研究分离出了参与Pfs激活的三个主要信号通路,即PTEN-PI3K-Akt/转录因子叉头盒O-3(FOXO3)、哺乳动物雷帕霉素靶复合物1(mTORC1)和Hippo通路(图2)。

图2:生物疗法治疗卵巢早衰的潜在机制。
图2:生物疗法治疗卵巢早衰的潜在机制。

要在体外模拟PTEN-PI3K-Akt/FOXO3和mTORC1通路的作用,需要使用Akt刺激剂,而卵巢破碎则会抑制Hippo通路,同时激活Pfs。在PTEN-PI3K-Akt/FOXO3激活Pfs的过程中,酪氨酸激酶受体会增强 PI3K的活性,进而激活Akt信号。PTEN-PI3K-Akt/FOXO3的激活会诱导mTORC1,进而提高Pfs的存活率。另一方面,Hippo信号通路通过使转录PDZ结合基序(TAZ)信号和相关蛋白1(YEP)失活来调节器官的大小。YEP和TAZ信号反过来又调节细胞间信号蛋白的表达,促进Pfs的生长。

2013年,Kawamura等人结合了有关Pfs激活机制的知识,并将其应用于体外受精技术的临床实践。因此,POI患者首次实施了体外激活(IVA)程序。有两项研究和两份病例报告采用了上述IVA技术。后者仅限于不使用Akt诱导剂的卵巢破碎。IVA过程共导致6例妊娠,其中3例成功活产,2例流产,1例在发表时仍在妊娠(表1)。根据这些研究,最重要的观察结果是,只有对取出的卵巢进行组织学检查发现原始卵泡的患者才能取回成熟卵母细胞。

干细胞治疗卵巢早衰

干细胞疗法主要使用人类多能干细胞 (hPSC) 和MSC。干细胞疗法可以是自体的,使用患者自己的干细胞,也可以是同种异体的(由健康捐赠者提供的干细胞)。与PRP一样,SC已应用于多种人类疾病,包括神经系统疾病、肺功能障碍、代谢/内分泌相关疾病、生殖障碍、皮肤烧伤、心血管疾病和肝脏疾病。

在POI动物模型中,自体或异体干细胞治疗可恢复荷尔蒙分泌(E2、FSH)、卵巢重量/结构、卵泡数量、排卵/发情周期和妊娠率。

有关间充质干细胞移植在POI患者中应用的临床数据很少,仅来自病例报告和最多15人参与的少量临床试验(表1)。这些临床试验使用了自体BMSCs、异体UC-MSCs、脂肪组织来源的基质细胞(ADSCs)和月经血来源的间充质干细胞(Men-MSCs)。根据报告的结果,间充质干细胞诱导月经恢复的比例为2.9%-44%,在一个病例报告中,诱导率高达100%,而且还能改善更年期症状。进一步观察到的变化包括 E2水平升高、FSH 水平降低和LH水平降低、卵巢体积增大和卵巢低血容量增加、子宫内膜厚度增加和子宫内膜血流量增加,活检记录显示子宫内膜从萎缩转变为分泌性子宫内膜。

2015年在中国就在国际上率先开展间充质干细胞干预卵巢早衰合并不孕症临床研究。

来自安徽的方女士于2015年12月开始作为受试者入组(脐带间充质干细胞干预卵巢早衰合并不孕症临床研究),术后复查,卵巢血流有明显改善,2016年方女士又进行了两次移植。2017年5月,方女士经检查确认大卵泡活动,当月实现自然受孕。2018年1月12日,方女士在南京顺利诞下该项目实施以来的首位健康男婴。

干细胞治疗卵巢早衰的机制

  • 干细胞的旁分泌机制,激活卵巢细胞活力
    • 分泌各种细胞因子修复卵巢和子宫内膜,如分泌的血管内皮生长因子和肝细胞生长因子减少了颗粒细胞凋亡并恢复了卵泡发育;
  • 干细胞的可再生功能,改善卵巢功能
    • 归巢至卵巢部位进行分化再生,干细胞自身也会被卵巢组织诱导分化为颗粒细胞从而恢复卵巢储备功能;
  • 干细胞的营养支持,促进卵巢血管再生
    • 为卵巢输送营养物,如血管内皮生长因子和循环生长因子-2,尤其是血管生成素,将会促进干细胞定植组织的血管新生;
  • 干细胞的抗纤维化特性,恢复卵巢弹性
    • 保护卵巢间质,缓解子宫内膜粘连,间充质干细胞不分化为卵母细胞或颗粒细胞,但它们可能通过在卵巢卵母细胞周围的微环境中发挥重要的辅助作用来恢复卵巢功能。

微小核糖核酸

微小RNA是18-24个核苷酸长的非编码RNA,可调节细胞的增殖、分化和凋亡。近年来,人们越来越认识到它们在POI中的致病作用,它们通过调节特定通路,如PI3K/Akt/mTOR、TGFβ、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和Hippo通路,参与类固醇生成、颗粒细胞增殖/凋亡、自噬和卵泡发育。这些分子中有许多在POI模型中上调或下调,并被提议作为生物标记物。尤其miR-122-5p、miR23α、miR146α和miR27α,已被证明可分别通过B细胞淋巴瘤9(BCL-9)、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)、caspase级联通路和SMAD5诱导颗粒细胞凋亡(106-108);此外,miR-127-5p可通过HMGB2基因削弱颗粒细胞的修复能力。

这一认识刺激了研究,以调查micro-RNA在化疗诱导的POI小鼠模型中潜在的疾病缓解作用,迄今为止,取得了有希望的结果。例如,源自人UC-MSCs外泌体的miR-17-5p通过抑制Sirtuin7 (SIRT7) 表达,促进受损颗粒细胞和卵巢细胞的增殖并减少氧化应激。此外,miR-29α通过靶向wingless相关整合(Wnt)/β-catenin通路,促进颗粒细胞增殖并抑制其凋亡,保留现有成熟卵泡并恢复卵巢功能。截至目前,尚无microRNA用于POI患者的临床数据。

线粒体靶向治疗

线粒体功能障碍主要与卵巢衰老有关。此外,特发性POI患者已被证明线粒体DNA含量显着降低,携带更多线粒体突变,特别是在呼吸链中,并具有较高的活性氧水平和较低的三磷酸腺嘌呤水平,与有生育能力的健康女性相比。这些发现表明线粒体功能障碍与POI的发病机制有关。

线粒体替代疗法已被应用于各种病因导致的低质量卵母细胞妇女,但不适用于POI人群。异体线粒体替代疗法,即在体外受精过程中将年轻、健康的捐赠者的线粒体移植到植入前胚胎中,由于异体风险的伦理问题,2001年已被FDA禁止使用,随后在2015年,英国再次规定谨慎选择的病例可以合法使用。自2019年起,由于缺乏确凿的科学证据证明线粒体捐赠的安全性和有效性,ESHRE强烈反对线粒体捐赠。遗憾的是,在一项大规模三盲随机对照试验(AUGMENT)中,试图在卵胞浆内单精子注射(ICSI)过程中将自体线粒体从造血干细胞的线粒体移植到胚胎中,结果显示受精率和非整倍体率都没有提高,因此该研究不得不终止。

针对线粒体功能的营养素(例如Q10、白藜芦醇和褪黑素)的研究表明,后者可能通过提高抗氧化能力、维持端粒酶活性和激活Sirtuin1来有效延缓卵巢衰老。最后,光生物调节疗法 (PBMT) 结合低强度激光疗法 (LLLT) 已知可通过靶向线粒体膜中的发色团细胞色素C氧化酶发挥其恢复活力的效果。

结论和未来展望

POI是一种病因异质性的病症,影响全球高达3.7%的女性人口。尽管激素替代疗法可以改善其症状和长期健康后果,但它无法治疗不孕症,而不孕症被认为是该疾病最具破坏性的方面。将卵巢储备功能重新概念化为动态而非静态细胞群,再加上观察到 50%的POI患者的卵巢中保留有Pfs,这些都指导了卵巢年轻化的新颖生物学策略的研究。这些包括PRP、exos疗法、IVA、SC疗法、microRNA和线粒体靶向疗法

目前,POI生物疗法前景广阔,但仍处于初步试验阶段。至于已经应用于临床的技术,即PRP、IVA和SC移植疗法,由于所进行研究的随访时间较短,我们无法就每种方法的卵巢再生持续时间或安全性得出结论。此外,由于缺乏有关PRP制备和使用的标准化方案,因此比较不同研究之间的差异也是一个问题。

  • 近年来,干细胞治疗卵巢早衰的前景光明,为患者带来康复希望。虽然干细胞在临床治疗POF已经逐步开展,但还有许多问题亟待解决。干细胞通过抗炎、抗氧化、抗纤维化、抗凋亡等过程修复卵巢组织功能,其机制仍需进一步研究阐明,治疗后的长期作用仍需进一步验证。因此,我们需要设计适当的对照临床试验,以评估这些程序的有效性、安全性和可重复性。

最后,鉴于不孕症是对POI进行生物治疗的唯一指征,因此成功与否的评估应基于临床生育指数,如临床妊娠的成功率和带回家的婴儿数量,而卵巢储备指数,如AMH和AFC,也能提供信息。单独的激素水平改善虽然可取,但并不能证明此类疗法的成功,因为传统的POI治疗可通过使用HRT来实现。

据ClinicalTrials.gov称,目前有8项关于PRP应用的临床试验正在进行中,3项关于IVA,5项关于干细胞移植,预计将在未来2年内获得结果

精心设计的实验和临床研究将阐明我们对POI不孕不育新疗法的安全性和有效性的理解。

参考资料:Moustaki M, Kontogeorgi A, Tsangkalova G, et al. Biological therapies for premature ovarian insufficiency: what is the evidence? Frontiers in Reproductive Health. 2023 ;5:1194575. DOI: 10.3389/frph.2023.1194575. PMID: 37744287; PMCID: PMC10512839.

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干细胞衍生的细胞外囊泡在多囊卵巢综合症治疗中显示出前景
« 上一篇 2023年12月19日

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