间充质干细胞治疗肝病：现状与展望

间充质干细胞移植是一种治疗慢性肝病的新兴疗法。临床前和临床研究已经评估了这种疗法的潜力。尽管间充质干细胞移植的机制仍未完全明了，但不断积累的证据显示，间充质干细胞的免疫调节、分化和抗纤维化特性在肝脏再生中发挥着至关重要的作用。许多临床研究已观察到间充质干细胞对慢性肝病患者的安全性和治疗效果。然而，由于目前移植细胞的可行性有限，治疗效果仅略有改善。

在此，我们讨论了几种旨在提高细胞移植活力的策略，以及未来使用基于细胞外囊泡的疗法治疗肝病的潜在挑战。

介绍

慢性肝损伤，例如由病毒感染、酗酒或代谢性疾病引起的肝损伤，会导致肝硬化和衰竭。终末期肝硬化的最终治疗方法是肝移植。然而，在许多国家，移植并不容易获得，而在可以进行移植的国家，器官短缺和与移植相关的高昂费用使得这对许多患者来说是不切实际的选择。

干细胞移植已被提议作为肝病患者预防进展和治疗晚期纤维化患者的潜在策略。干细胞移植，包括造血干细胞、诱导多能干细胞和间充质干细胞 (MSC)，可被操纵分裂成肝细胞样细胞体外和体内。在这些细胞类型中，MSC已被证明具有相对容易获得和具有低免疫原性的优点。它们具有自我更新能力，可以分化成各种谱系的细胞，包括成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。此外，间充质干细胞在伦理方面是安全的，因为它们并非源自体细胞。此外，间充质干细胞移植被认为是安全的，并在各种疾病的临床环境中进行了广泛评估，并取得了有希望的结果。

本综述的目的是介绍间充质干细胞在肝脏疾病中的治疗效果，以解决有关有效性、安全性和可能涉及的风险的问题，并讨论基于间充质干细胞的临床治疗的最新临床进展，为进一步治疗肝病开辟新的道路。

间充质干细胞移植概述

间充质干细胞移植的定义和来源

间充质干细胞可以分化为中胚层或外胚层细胞，从而产生贴壁的多能成纤维细胞型干细胞。不同的研究人员以不同的方式定义MSC特征。为了解决这个问题，国际细胞治疗学会推荐了一组三个标准来定义人类间充质干细胞：粘附性、特异性表面抗原表达和多能分化潜能（表1）。

MSC可以从大多数器官或组织中分离出来，包括骨髓（BM）、脐带血（UCB）、脂肪组织（AT）、外周血、骨小梁、滑膜、软骨和肌肉。其中，三个主要来源已被证明能够治疗肝病：BM-MSC、UCB-MSC和 AT-MSC。一般来说，众所周知，这三种来源的间充质干细胞表达相似的表面抗原，但它们的形态和增殖率各不相同。

间充质干细胞移植治疗肝病的治疗机制

1) 转分化为肝细胞样细胞

源自间充质干细胞的肝细胞样细胞被认为是肝脏再生的替代来源。MSC的肝分化受到多种因素的影响。首先，间充质干细胞可以通过多种细胞因子和生长因子处理，如肝细胞生长因子（HGF）、成纤维细胞生长因子-2/4、表皮生长因子、制瘤素M、白血病抑制因子、地塞米松、胰岛素等，分化为肝细胞样细胞。此外，与肝细胞和沉淀培养物共培养可以诱导MSC分化为肝细胞样细胞。然而，在临床前环境中，MSC转分化为肝细胞的比例不到肝脏总质量的1%。应开发更有效的肝细胞分化技术，利用肝细胞分化的MSC治疗肝脏疾病。

2）免疫调节

炎症引起的慢性肝损伤伴随着T细胞、B细胞和单核细胞的浸润（图1）。

据报道，免疫抑制剂有利于肝移植前后的肝再生。在这方面，间充质干细胞的免疫调节特性可以对肝脏疾病产生有利的影响。首先，间充质干细胞可以通过释放各种可溶性因子来下调T细胞，例如一氧化氮、前列腺素E（PGE）-2、吲哚胺2,3-双加氧酶、白细胞介素（IL）-6、IL-10和人白细胞抗原G。这些因子可以控制各种免疫细胞的增殖和功能，并上调Treg细胞。MSC 还可以通过直接与 T 淋巴细胞相互作用来抑制T细胞的增殖。

MSCs的免疫抑制能力是由干扰素-γ、IL-1a和肿瘤坏死因子(TNF)-α等细胞因子的组合产生的。这些细胞因子帮助一些趋化因子和免疫细胞与MSC保持接触并调节免疫反应。此外，MSC可以抑制B细胞的活化，降低免疫球蛋白的水平。最后，MSC已被证明可以诱导炎症巨噬细胞向替代巨噬细胞极化。这种改变释放出可改善肝损伤的可溶性因子（即IL-10和IL-1Ra）。

3) 抗纤维化活性

慢性肝损伤导致静止的肝星状细胞 (HSC) 转分化为纤维化肌成纤维细胞，产生过量的ECM蛋白并导致纤维化。MSC治疗可通过间接或直接细胞间接触来减弱活化HSC的增殖和胶原蛋白沉积。在间接接触机制中，MSC分泌的几种可溶性因子（即TNF-β3、TNF-α、IL-10和HGF）会减弱胶原合成，而HGF和神经生长因子则诱导HSC凋亡。接下来，与HSC共培养的MSC通过细胞间接触抑制HSC的增殖和α-平滑肌肌动蛋白 (SMA) 的表达。众所周知，基质金属蛋白酶（MMP）和MMP组织抑制剂（TIMP）有助于肝纤维化的进展和消退。在一些纤维化模型中，MSC调节MMP（即MMP-2、-9、-13和-14）和TIMP-1的表达。增加MMPs的表达并减少TIMPs的表达。

我们准备好在常规临床实践中进行间充质干细胞移植了吗？

间充质干细胞移植的有效性和安全性现状

多项临床试验已经阐明了间充质干细胞治疗慢性肝病的优势（表2）。

Study (year)	Liver disease	Patients, sample size (MSC/control)	Cell source	Graft type	Injection route	Cell doses	Duration of follow-up (mo)	Primary outcomes
Mohamadnejad et al. (2007)	Decompensated LC	4/0	BM	Auto	PV	31.7×106	12	MELD score, liver function test, and liver volumes
Kharaziha et al. (2009)	LC (MELD ≥10)	8/0	BM	Auto	Portal vein (n=6)	3.0–5.0×107	6	MELD score, liver function test, and serum creatinine
or PV (n=2)
Amer et al. (2011)	Chronic HCV-associated LC	20/20	BM	Auto	1) IS (n=10)	2.0×107	6	MELD score, Child-Pugh score, ascites, edema, liver function test, and fatigue
2) IH (n=10)
Peng et al. (2011)	Chronic HBV-associated liver failure	158/0	BM	Auto	HA	1.0×106	12	MELD score, liver function test, and self-reported symptoms
El-Ansary et al. (2012)	Chronic HCV-associated LC	15/10	BM	Auto	PV	1.0×106	12	MELD score and serum albumin level
Shi et al. (2012)	Chronic HBV-associated liver failure	24/19	UCB	Allo	PV	0.5×106	12	MELD score, liver function test, and survival rates
Zhang et al. (2012)	Chronic HBV-associated decompensated LC	30/15	UCB	Allo	PV	0.5×106	12	MELD score, ascites, and liver function test
Amin et al. (2013)	Chronic HCV-associated LC	20/0	BM	Auto	IS	1.0×107	6	MELD score and liver function test
Mohamadnejad et al. (2013)	Decompensated LC	15/12	BM	Auto	PV	1.0×106	12	No improvement
Wang et al. (2013)	UDCA-resistant PBC	7/0	UCB	Allo	PV	0.5×106	12	Serum alkaline phosphatase and γ-GT levels
Jang et al. (2014)	Alcohol-related LC	11/0	BM	Auto	HA	5.0×107	4	MELD score and liver histology
Salama et al. (2014)	Chronic HCV-associated LC	20/20	BM	Auto	PV	1.0×106	6	MELD score and Child-Pugh score
Wang et al. (2014)	UDCA-resistant PBC	10/0	BM	Allo	PV	3.0–5.0×105	12	Serum levels of ALT, AST, γ-GT, and IgM
Xu et al. (2014)	Chronic HBV-associated LC	27/29	BM	Auto	HA	8.45×105	6	MELD score improvement and reduction in IL-6, IL-17, TNF-α levels
Suk et al. (2016)	Alcohol-associated LC	37/18	BM	Auto	HA	5.0×107	12	Child-Pugh score and Histologic fibrosis
Lanthier et al. (2017)	Decompensated alcoholic hepatitis	28/30	BM	Auto	HA	4.7×107	1	No improvement
Lin et al. (2017)	Chronic HBV-associated liver failure	56/54	BM	Allo	PV	1.0×106	6	MELD score and survival rates
Detry et al. (2017)	Liver transplant recipients	10/9	BM	Allo	PV	1.5–3.0×106	12	No difference of rate of infection or de novo cancer

Mohamadnejad进行的一项试点研究等人。2007年的第35次研究表明，输注自体间充质干细胞治疗四名失代偿性肝硬化患者是安全可行的。6个月时，四分之三的患者的终末期肝病模型 (MELD) 评分有所改善，其中两人在12个月内保持稳定。

Amer进行的一项2期研究中等人。2011年发表的第37篇文章中，40名丙型肝炎相关肝硬化患者被随机分为两组，每组20名患者：第一组接受自体骨髓来源的间充质干细胞，第二组接受最佳支持治疗。与第二组相比，第一组的Child-Pugh和MELD评分显着改善，并维持了6个月。

施等人报道，24名乙型肝炎相关慢性肝衰竭患者接受静脉UCB-MSC输注治疗，19名患者接受生理盐水治疗作为对照。UCB-MSC输注显着提高了72周的存活率，并且直到随访结束才观察到明显的副作用。

阿明也得到了类似的结果等人研究表明，脾内自体移植改善了20名丙型肝炎相关性肝硬化患者的肝功能，具体表现为总胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸氨基转移酶水平和凝血酶原时间显着降低，凝血酶原时间显着增加。

Jang发表的开放标签试验等人。2014年的45项研究表明，通过肝动脉进行自体BM-MSC移植治疗酒精滥用相关的肝硬化具有有益效果。54.5%的患者观察到组织学改善；第二次注射后12周，Child-Pugh评分从7.1提高到5.4，纤维化相关标志物包括TNF-β1、1型胶原和α-SMA的水平显着下降。

最近，一项随机2期试验报道，对72名酒精相关性肝硬化患者进行肝动脉注射自体BM-MSC可以减轻肝纤维化并改善Child-Pugh评分。

最近的一项临床研究还报告了肝移植受者接受间充质干细胞治疗的可行性、安全性和耐受性（n=10）。间充质干细胞治疗已被认为对缺血/再灌注损伤具有潜在的有益作用。这项研究为利用间充质干细胞作为未来潜在的治疗方法为需要终生免疫抑制的肝移植受者开辟了道路。

然而，两项临床研究获得了阴性结果。穆罕默德内贾德等人报告称，与对照组（n=12）相比，通过外周静脉注射的自体BM-MSC移植（n=15）可能没有任何有益效果。在12个月的随访中，MSC 治疗组和对照组之间 Child-Pugh 评分、MELD 评分、血清转氨酶水平和肝脏体积的绝对变化没有差异。

另一项研究报道，28名酒精性肝炎患者接受了自体BM衍生的CD34⁺治疗干细胞和间充质干细胞以及30名患者仅接受支持疗法。4周随访时肝活检中增殖性肝细胞数量两组间无显着差异。然而，与接受标准治疗的患者相比，接受干细胞治疗的患者表现出更活跃的肝脏巨噬细胞扩张。

大多数研究表明干细胞疗法对于肝病患者是安全有效的。然而，许多此类临床研究的试验设计的规模和性质意味着无法得出有意义的结论，因此其疗效尚未得到证实。

间充质干细胞移植途径

关于移植的间充质干细胞的植入存在相互矛盾的数据，并且对其纤维化潜力提出了一些担忧。这些不良影响似乎取决于间充质干细胞输注的途径和剂量。尽管据报道效果因注射途径而略有不同，但间充质干细胞可以通过静脉注射、肝内注射、腹膜内注射、脾内注射或门静脉注射移植到肝脏中。外周静脉被认为是最常见的移植途径，其次是肝动脉、脾内注射、肝内注射和门静脉。通过外周静脉施用的BM-MSC已被证明在慢性损伤的情况下可以很好地迁移到肝实质中体内。

相比之下，在急性损伤环境中观察到有限的MSC植入。此外，当通过肝内动脉注射时，间充质干细胞在肝组织中持续存在，这表明间充质干细胞是存在的，并且不会分化为肝细胞。此外，在临床试验中，门静脉输注比外周途径更有效。然而，直接方法，例如通过门静脉或肝动脉，可能会带来细胞注射后门静脉高压出血的风险。总体而言，到目前为止，大多数临床研究提供的证据还相当缺乏。

间充质干细胞移植的潜在风险

迄今为止，关于MSC治疗慢性肝病的临床和临床前研究已经开展，但必须谨慎考虑几个问题，包括致癌和病毒传播的可能性。间充质干细胞可以分泌多种生长因子，促进肿瘤细胞生长和血管生成。先前的实验研究表明，恶性形成的倾向取决于传代次数。例如，在小鼠间充质干细胞中，传代超过3次后就观察到染色体异常和转化为恶性细胞，例如肉瘤。此外，MSC可能在多次传代后表现出端粒缺失。尽管临床试验中尚未观察到人类间充质干细胞的恶性转化，但由于随访时间太短，大多数人间充质干细胞的肿瘤发生并不明显。因此，在MSCs移植前必须分析染色体完整性，以确保手术的安全性。

与自体移植相反，同种异体移植可能存在病毒传播给患者的风险。尽管已证明细小病毒B19可以病毒传播至 BM细胞体外, B19阳性MSC相关病毒血症尚未在人类中报道。然而，目前尚无关于单纯疱疹病毒（HSV）和巨细胞病毒（CMV）通过间充质干细胞传播的信息体内。因此，由于免疫抑制患者存在感染的可能性，MSC受体和供体可能都需要进行细小病毒B19、HSV和CMV筛查。

肝病间充质干细胞移植的未来方向

临床研究表明仅具有中等益处，至少部分是因为无论细胞来源如何，移植细胞的活力有限。甚至有报道称，由于移植时遇到的微环境缺乏灵活性，移植细胞的存活率不到1%。在本节中，我们将回顾用于提高 MSC移植中细胞治疗效果的策略（图2）。

1. 组织工程

组织工程方法的目的是让细胞在开始再生之前在移植器官中归巢和适应，从而提高细胞存活率。ECM在细胞组织和功能中起着至关重要的作用。已经研究了多种方法，包括共培养和3维 (3D) 系统的开发。在3D系统中生长的细胞可能表现得更像细胞体内并直接植入。这些3D系统可分为基于支架的系统和无支架系统。

几种合成聚合物，包括聚乳酸共乙醇酸 (PLGA) 和天然材料，如胶原蛋白，已被评估其在肝分化过程中增加 MSC中肝细胞特异性基因表达的能力。事实上，在PLGA支架上共培养BM来源的MSC和分离的新鲜肝细胞时，显示了肝功能的调节。使用MSC与肝细胞比例为1:5时观察到的性能效果最大体外和体内。除了基于支架的3D系统外，多个小组还评估了生物支架（例如脱细胞组织）的作用。脱细胞肝组织形成ECM支架，可以通过提供更生理的环境来改善MSC植入。

2. 预处理提高细胞抵抗力

在治疗过程中，间充质干细胞被移植到病理疾病条件下。换句话说，病理条件使植入的细胞面临严重的酸性、氧化和营养应激。在这方面，移植前修饰供体细胞有助于这些细胞抵抗恶劣条件，从而改善细胞功能。几种预处理策略包括通过将细胞暴露于物理或环境冲击以及目标分子的药理学调节剂来促进广泛的促生存反应。

3. 基因工程

已经研究了几种方法来促进参与供体细胞归巢的蛋白质的表达。MSC已被证明表达低水平的分子，包括归巢因子、基质细胞衍生因子1和趋化因子受体（即CXCR4和CCR1受体）。对促存活或抗凋亡基因（包括 Bcl-2、蛋白激酶 B (Akt/PBK)、HGF 和存活蛋白）进行基因操作可提高 MSC 存活率体内。众所周知，miRNA可以调节mRNA，调节细胞基因网络，包括那些参与细胞存活的基因网络。miRNA过度表达已被证明可以提高MSC的存活率。然而，在应用基因操作时必须仔细考虑几个问题，包括致癌风险。

4. 细胞外囊泡作为无细胞疗法

间充质干细胞可以分泌具有旁分泌作用的可溶性分子或释放更复杂的结构，称为细胞外囊泡（EV）。EV通过与细胞表面相互作用、内化或与细胞膜融合来发挥许多作用。这些EV可以被设计来改善预期活性的表达或引入特定的效应分子。

结论

间充质干细胞再生疗法通过其免疫调节、分化和抗纤维化特性对慢性肝病有效。许多临床研究已证明间充质干细胞可通过改善组织纤维化和改善肝功能来治疗受损的肝细胞。然而，仍然存在一些问题，包括迁移率低、细胞存活率低以及致癌和病毒传播的风险。我们回顾了几种增强其功效的策略，包括改变培养环境和/或启动 MSC以及细胞基因工程。此外，MSC产生的EV似乎通过保留细胞的至少一些免疫调节特性，作为基于MSC的移植中的无细胞细胞疗法具有治疗益处。

基于间充质干细胞的慢性肝病细胞疗法的前景将取决于细胞来源、培养条件、给药途径的标准化以及未来大规模临床试验的结果。

主要参考文献：

Kang SH, Kim MY, Eom YW, Baik SK.  Mesenchymal Stem Cells for the Treatment of Liver Disease: Present and Perspectives.  Gut and Liver 2020;14:306-315.  https://doi.org/10.5009/gnl18412

免责说明：本文仅用于传播科普知识，分享行业观点，不构成任何临床诊断建议！杭吉干细胞所发布的信息不能替代医生或药剂师的专业建议。如有版权等疑问，请随时联系我。