干细胞疗法在帕金森病中的制备与应用综述：现状与未来展望

帕金森氏病 (PD) 是一种进行性神经退行性疾病，其隐含特征是黑质致密部 (SNpc) 中多巴胺能 (DA) 神经元逐步丧失，并明确表现为运动迟缓、强直、静止性震颤和姿势不稳。

目前，可用的治疗方法主要是姑息策略，包括 L-3,4-二羟基苯丙氨酸 (L-DOPA) 替代疗法、DA 受体激动剂和深部脑刺激 (DBS) 程序。然而，随着疾病的进展，药物治疗效果不可避免地会消失，更糟糕的是，运动反应振荡的副作用以及 L-DOPA 诱发的运动障碍 (LID)。因此，上述令人沮丧的状况推动了向细胞替代疗法 (CRT) 的转变，一种有前途的恢复疗法，旨在确保患者症状的持久缓解。

目前，研究最多的用于DA神经元衍生的干细胞来源是人胎儿腹侧中脑（hfVM）细胞、人胚胎干细胞（hESCs）、人神经干/前体/祖细胞（hNSCs/hNPCs）、人间充质干细胞(hMSCs)、人诱导神经干细胞 (hiNSCs) 和人诱导多能干细胞 (hiPSCs），它们有望成为恢复性治疗方案（见图1)。关于PD，估计SN中 30%的DA细胞损失以及纹状体DA神经元神经支配减少60%以上可导致临床特征的出现。

因此，任何类型的CRT方案都需要将黑质纹状体系统至少恢复到正常水平的30%才能有效。为了保证未来基于干细胞的CRT的标准化和均质化，理想的评估标准应符合以下协议：

1. 产生足够的可用于移植的神经谱系特异性细胞系；

2. 植入后细胞的持续存活（即数年）；

3. 分化成足够数量（大约 100,000 个）的黑质 DA 神经元，并有证据表明移植细胞释放多巴胺；

4. 这些细胞移植后的行为恢复；

5. 没有证据表明肿瘤形成或分化为进一步破坏黑质纹状体回路的神经元/细胞；

6、符合药品生产质量管理规范（GMP）标准；

在这篇综述中，我们建议详细介绍干细胞系的制备和应用，尤其是用于PD研究和治疗的ESC、NSC/NPC、iNSC、MSC和iPSC（见图1）。由于更优越的多能性、更独特的分化特征和更多认可的来源，iPSC似乎是更优先的CRT候选者。此外，还将阐述PD患者实用干细胞治疗的现状、未来前景和CRT相关炎症问题。

胚胎干细胞 (ESC)

ESCs来源于发育中囊胚的内部团块，在某些正常情况下具有自我更新和产生所有三个主要胚层——外胚层、中胚层和内胚层的细胞的潜力（见图1）。

在体外诱导ESC进一步分化的尝试涉及几种不同的方法（参见图2）。

整个过程分为以下三个步骤： (1) 从胚泡内块分离胚胎干细胞；(2) 通过 (i) 应用形态发生素或可溶性生长因子诱导ESC分化为DA神经元；(ii) 饲养细胞共培养；(iii) 遗传操作；(iv) 底板谱系诱导策略；(3) 通过功能整合和内源性NPCs动机在PD治疗中移植诱导的DA神经元。

例如，通过应用多种形态发生素如全反式维甲酸 (RA)、声波刺猬 (SHH)、成纤维细胞生长因子 (FGF)、表皮生长因子 (EGF)、骨形态发生蛋白，显着改善了神经谱系诱导(BMPs) 和神经胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）所有这些都用作神经源性刺激物，这对于正常的胚胎发育和分化也是必不可少的（见表1）。

到目前为止，已有多项证据表明，源自ESC的富含DA的移植物在移植到PD动物模型后通常保持其DA诱导的表型、延长的神经突向外生长、表达突触标记并产生相当大的行为恢复（见表1)。与PD动物模型的结果类似，接受人类胎儿组织移植的患者表现出运动缺陷显着减少，移植物存活率、多巴胺释放和DA神经元的突触整合。

主要问题

然而，与所有多能干细胞的情况一样，hESC 可能会在预期的移植区域产生畸胎瘤。此外，移植的胚胎干细胞可能会穿过血脑屏障，在功能上整合到异位脑区并分泌活性因子，从而对中枢神经系统（CNS）产生不良影响。此外，同种异体 hES 细胞及其衍生物在移植到受体大脑中时可能会引起免疫排斥反应。除此之外，移植物引起的肌张力障碍和运动障碍是另一个棘手的问题。针对以上担忧，未来的干细胞研究可以做些什么呢？

总的来说，必须通过荧光激活细胞分选 (FACS)、磁激活细胞分选 (MACS)、有丝分裂阻滞和/或定向分化等方法，从最终移植产品中去除或减少残余ESC至安全水平，以便减少致瘤危害。此外，对移植细胞生物分布、潜在异位毒性的评估以及对ESC衍生细胞的免疫状态和经历神经退行性损伤的CNS的了解将更好地保证基于 ESC 的 CRT 在PD中的成功。遗憾的是，由于上述潜在问题，到目前为止，还没有美国食品和药物管理局 (FDA) 批准使用 hESC 衍生细胞在 PD 患者中进行移植的正在进行的临床试验。然而，鉴于迷人的内在分化能力和全球研究人员的共同努力，hESCs 衍生的 DA 神经元必将达到临床阶段并转化为临床应用。

神经干细胞 (NSC)

1990年代早期在成年哺乳动物中枢神经系统中发现干细胞和祖细胞，挑战了著名科学家 Ramony等人长期存在的“无新神经元”学说。打开神经干细胞用于PDCRT的潜力的窗口。NSCs是干细胞的一种亚型，能够在胚胎和成人中自我更新并产生神经系统的主要表型，致力于神经谱系分化，并可能在体内形成神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。

神经干细胞移植在帕金森病治疗中的制备（直接分离或诱导分化）和各自应用的流程图

NSCs可分为三类：（1）内源性NSCs，直接从成人CNS组织中分离（A）；

(2) 干细胞衍生的NSCs，通过不同的分化方案从各种干细胞诱导(A)；

(3) iNSC，由Sox2从小鼠或人成纤维细胞重新编程，有或没有其他转录因子(B); 所有这些都可以进一步分选和纯化以获得可行的NSCs。

其中，干细胞衍生的神经干细胞可以通过以下两种方案进一步诱导分化为多巴胺神经元：（i）添加生长因子、神经营养因子、细胞因子等。培养基诱导神经球形成；(ii) 与永生化 NSC 系共培养以引入基因修饰因子。当将上述可行的NSCs和感受态DA神经元应用于PD的CRT治疗时，可以观察到改善的神经元存活状态和恢复性功能缺陷。

PD是一种与衰老相关的神经退行性疾病，被认为是受影响大脑区域NSCs池缺乏的结果，是CRT的合适候选者。因此，高度期待将NSCs（内源性NSCs、iNSCs或干细胞衍生的神经干细胞）替换到受损大脑中作为PD的可能治疗手段（见图1）。在成功建立多种来源的神经干/前体/祖细胞 (NPC/NSC) 后，快速、可靠和长期生产人类NPC对神经科学家和临床神经移植试验都具有巨大的实用价值。

PD是一种与衰老相关的神经退行性疾病，被认为是受影响大脑区域NSCs池缺乏的结果，是CRT的合适候选者。因此，高度期待将NSCs（内源性 NSCs、iNSCs或干细胞衍生的神经干细胞）替换到受损大脑中作为PD的可能治疗手段（见图1）。在成功建立多种来源的神经干/前体/祖细胞 (NPC/NSC) 后，快速、可靠和长期生产人类 NPC 对神经科学家和临床神经移植试验都具有巨大的实用价值。

间充质干细胞 (MSC)

MSCs是一种非造血多能亚型细胞系，主要来源于骨髓的基质结构 ，而不是脂肪组织、脐带、真皮和外周血，在体内一般分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞(见图1)。

一般而言，有两类MSC：天然MSC（直接从间充质组织分离）和神经诱导的MSC，它们都对PD治疗具有巨大前景（见图4）。其中，天然骨间充质干细胞（BMSCs）和神经诱导骨间充质干细胞（BMSCs）均已通过多组PD模型的治疗效果测试，均显示移植细胞存活、TH表达和明显的行为恢复，但神经诱导的 BMSCs 的修复效果似乎更明显。此外，从脂肪组织和脐带中分离出的MSCs在PD模型中同样显示出有益效果。此外，基因工程MSCs也被证明在PD治疗中表现出治疗潜力。大量研究表明，生长因子（特别是 GDNF、VEGF 和神经营养因子）的蛋白质或基因递送在一系列啮齿动物和灵长类PD模型中有效保护多巴胺神经元（见表1）。

MSCs可分为三种类型：naïveMSCs、神经诱导的MSCs和基因工程的MSCs，它们都可以在移植后直接发挥内在治疗作用，例如（i）分泌中性粒细胞因子、生长因子等；(ii) 内源性 MSCs 动机、神经发生和血管生成；(iii) 免疫调节和抗炎作用。

此外，MSCs可以通过（i）化学刺激诱导分化为多巴胺神经元；(ii) 基因转染；(iii) 饲料细胞共培养；(iv) 使用条件培养基。移植后，MSCs 和分化的 DA 神经元表现出 (a) 在毒素损伤后持续的神经元存活；(b) 增强多巴胺神经元再生和修复；(c) 功能缺陷恢复。

迄今为止，有以下几种可能的潜在机制解释了MSC 对PD的治疗效果（见图6）。

1. 分泌各种生长因子、细胞因子、细胞外基质 (ECM) 蛋白和有效的神经调节分子，为神经再生创造有利环境。

2. 激活内源性恢复机制以促进神经发生、血管发生并减少 DA 神经元的损失（抗细胞凋亡）。

3.免疫调节和抗炎作用。

现状与未来展望

作为一种有前途的恢复性治疗替代方案，干细胞疗法作为一种有前途的再生疗法已成为PD研究领域的前沿，尤其是与MSC相关的疗法。一方面，MSC可以很容易地获得和扩展，而无需使用其他支持性细胞。另一方面，MSC不受与ESC相关的伦理和免疫排斥问题的影响。

遗憾的是，观察到的MSCs衍生神经元和神经胶质细胞的数量相当少，无法恢复正常的细胞结构，尽管一些体内研究表明MSCs能够在移植后分化为神经元细胞。因此，如何在未来的研究中产生足够多且特异的神经元或胶质细胞亚型以适应细胞移植是一个需要理顺的首要问题。与ESC和NSC的情况一样，应解决与肿瘤形成、免疫排斥和生物分布相关毒性相关的安全问题，以便最终将MSC转化为PD治疗选择。我们相信，尽管MSC研究仍处于临床管道的启动阶段，但 MSC 很有希望成为可用于PDCRT的干细胞库的成员。

诱导多能干细胞 (iPSC)

2006年Yamanaka 等人已经表明，ESC样细胞可以通过逆转录病毒引入OSKM基因转录因子从胚胎和成年小鼠成纤维细胞中衍生出来，后来获得诺贝尔奖奖励“发现成熟的体细胞可以重新编程以重新进入多能性”。从重编程过程中获得的类ESC多能细胞被称为iPSC（见图1）。

与其他类型的干细胞相比，iPSCs凭借更优越的多能性、更独特的分化特征和更容易获得的来源，似乎是更优先的CRT候选者。下文将进一步阐述多种多样的iPSCs的制备、应用、现状、潜在挑战和未来前景。

iPSCs在帕金森病中的应用

研究表明，基于蛋白质的人类iPSC很有希望成为临床转化的有前途的细胞来源，这些hiPSC的行为与hESC相似，没有异常衰老/细胞凋亡，没有显示任何外源性重编程基因表达，并且DA神经元来自人类piPSC显着改善PD啮齿动物模型中的行为缺陷（参见表3)。总之，对于与PD相关的干细胞研究和治疗领域，除了现有的基于病毒和蛋白质的iPSCs外，还应将更多的精力和注意力投入到多元化建立的iPSCs上，这将极大地促进CRT的进一步发展如果实施，用于PD治疗。

现状与未来展望

一般来说，理想的iPSCs的建立集中在适用的体细胞来源、重编程因子的适当组合、有效的递送方法和适当的培养条件。根据iPSC的目的和应用，有关体细胞类型、重编程因子、递送方法和培养条件的选择在很大程度上有所不同，其中详细阐述了重编程因子和递送载体。在上述协议的基础上，已经成功地建立了从各种体细胞到iPSC的转分化，并且iPSC衍生的DA神经元也被证明可以挽救PD动物模型中的运动缺陷。尽管取得了上述成就，但临床上可行的iPSC的生成仍然存在局限性。

用于帕金森病治疗的干细胞亚型的优缺点

胚胎干细胞、神经干细胞、间充质干细胞和iPSC等多种类型的干细胞已应用于PD相关的基础和实验研究，其中许多已转化为PD模型移植，结果参差不齐。分别阐述了上述干细胞的制备、诱导分化、初步应用、当前挑战和未来前景。然后比较干细胞亚型在PD治疗中的优缺点（见表4）。

ESCs来源于囊胚的内细胞团，可以全能分化为三个胚层，包括黑质DA神经。此外，ESCs衍生的DA神经元在移植到PD动物模型后已证明，神经突长出延长，特定突触标记物的表达和功能缺陷的缓解。然而，将这些细胞用于PD治疗仍然存在一些严重的问题，例如肿瘤形成的风险、伦理问题和免疫排斥，因此需要更多的研究以保证在PD治疗中的进一步应用。

至于NSC，与ESC相比的一个潜在优势是，除了神经谱系分化受限外，它们在移植后不易形成肿瘤和引起免疫排斥反应。然而，神经干细胞显示出一些缺点，如有限的分化能力和来源、挥之不去的伦理问题、帕金森症状的部分缓解。

相比之下，一些研究表明，间充质干细胞没有上述缺点，可能对神经系统疾病具有更大的治疗潜力。

结论

尽管细胞替代疗法是治疗帕金森和其他神经退行性疾病的有前途的途径，但仍然存在许多障碍，如肿瘤发生、免疫反应、低干细胞产量和生物分布相关的毒性，有待解决，以便能够开发出可以转化为有效且普遍接受的临床应用的新方法。除此之外，疾病阶段和严重程度也可能对细胞替代疗法的效果产生影响。总之，细胞替代疗法实践仍处于起步阶段，因此我们必须在未来的研究中建立更多的干细胞系，以推动与帕金森病相关的干细胞研究和治疗从实验室到临床。