神经干细胞外泌体成为治疗创伤性脑损伤的新策略

背景：大脑作为人类功能活动的“总部”，损伤后的再生和修复是当今科学界面临的难题。脑神经元具有难以再生的遗传特性以及创伤性脑损伤（TBI）后的抑制性微环境是神经修复的关键困难。

因此，TBI后功能恢复的重点是促进损伤后的神经再生，创造合适的微环境。越来越多的证据证明，使用干细胞来源的外泌体比直接移植干细胞可以在治疗TBI方面带来更多益处，为神经再生创造新的治疗途径。

自1987年Johnstone首次在绵羊网织红细胞中发现外泌体并将其命名为“外泌体”以来，目前用于脑再生的无细胞治疗策略已经得到发展。该领域取得了显着的进展，特别是在TBI再生修复中的应用。我们对外泌体生物学效应理解的进展对再生医学领域产生了重大影响，它们可以广泛用作脑修复细胞信号传导的有效介质。研究证实，外泌体对于大脑内外的细胞间通讯至关重要，表明外泌体不仅在细胞内短距离传输信号，而且还通过脑脊液广泛传播到整个大脑。

近日，国际《Stem Cell Research&Therapy》期刊发表了一项《神经干细胞来源的外泌体成为创伤性脑损伤的无细胞治疗策略》的综述，该综述首先描述了神经干细胞外泌体的基本特征和生物学效应。其次，总结了神经干细胞分泌的外泌体在TBI诊断和治疗中的作用及其可能机制。最后，讨论了神经干细胞外泌体治疗创伤性脑损伤所面临的挑战。

神经干细胞与外泌体概述

外泌体是细胞分泌的小囊泡，携带生物信息，并通过内体和质膜途径产生。外泌体不仅可以作为疾病诊断和治疗的生物标志物，而且可以作为细胞间通讯的主要媒介。此外，外泌体在膜细胞向细胞质蛋白、脂质和核糖核酸（RNA）的运输中发挥着关键作用。外泌体的生物发生包括其内容物以及随后的途径和机制。

神经干细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞，以替代因损伤而受损或耗尽的神经细胞。因此，神经干细胞可以作为一种天然的活跃活性资源，并被认为是治疗TBI的潜在工具。大量研究发现神经干细胞移植可以显着再生受损组织。NSC分泌的外泌体被认为可以增加基于干细胞的治疗的优势，因为它们能够克服其母体神经干细胞移植治疗的风险和困难。

有人提出神经干细胞外泌体可以自由穿透血脑屏障（BBB）、抑制细胞凋亡、介导免疫调节、抑制炎症和调节自噬。神经干细胞外泌体作为无干细胞治疗策略，可以满足修复和再生治疗的需求，成为TBI治疗的非常有前景的候选者。

外泌体含量及鉴定

外泌体富含脂质、蛋白质、核酸等生物活性物质，在调节细胞生理功能、影响细胞间信息传递中发挥着至关重要的作用。人们普遍认为，外泌体成分可能因其来源和细胞类型而异。外泌体已被鉴定含有4563个蛋白质、764个miRNA、1639个mRNA和194个脂质。

值得注意的是，人类神经干细胞（hNSCs）除了表达外泌体的常见标记蛋白CD63和CD81外，还表达神经干细胞的标记蛋白c-MYC蛋白。第二代测序显示，hNSC外泌体所含的miRNA与其他来源的miRNA不同。hNSCs分泌的miRNA有113种，其中高表达的miRNA有5种，包括hsa-miR-1246、hsa-miR-4488、hsa-miR-4508、hsa-miR-4492和hsa-miR-4516。作为高表达的miRNA之一，miR-1246是一种p53靶向miRNA，在调控细胞发育和凋亡方面发挥着重要作用。另一项研究表明，miR-21a在NSCs分泌的外泌体中高表达，可促进神经细胞的分化和再生（图1）。

神经干细胞外泌体可能通过作用于周围细胞来发挥作用。例如，神经干细胞衍生的外泌体，尤其是miR-9，通过抑制Hes1促进NSC分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。此外，外泌体分泌的miR-150-3p通过靶向CASP2来防止神经元凋亡，或者高水平的miR-21a可以促进NSCs分化为神经元，从而导致胶质疤痕减少

外泌体的发生途径和机制

外泌体作为细胞内的主要通讯媒介，可以通过不同途径与靶细胞结合以传递信息。目前普遍认为外泌体的生物合成主要涉及质膜途径和内体途径。在内体途径中，早期内体从质膜出芽形成早期内体；随后，早期内体萌发腔内囊泡（ILV）形成多囊泡体（MVB），最后，MVB与质膜融合释放外泌体。此外，一些证据已经证实外泌体可以直接从质膜出芽，即质膜途径。

目前，研究最多的外泌体生物发生途径是内体途径。细胞质膜内陷可形成早期内体，早期内体（Rab5为标志物）通过酸化和物质交换成熟为晚期内体（Rab7为标志物）。晚期内体最终可以形成含有ILV的MVB，ILV由多泡膜向内萌芽的凹陷构成。多囊泡通过与溶酶体或自噬溶酶体融合而被降解，与细胞质膜融合导致管腔囊泡分泌到细胞外，最终形成直径范围为40至160nm的外泌体（图2）。

外泌体的纯化和储存

由于外泌体体积小、密度低且成分相似，外泌体的分离对其分离提出了巨大的挑战。NSCs和其他细胞分泌的外泌体的常见分离方法主要包括超速离心、超滤和尺寸排阻层析、聚合物沉淀、免疫亲和捕获层析和微流控芯片分离。在这些方法中，超速离心是最常用的方法，目前被视为外泌体提取的金标准。此外，不同的分离技术也会影响外泌体的生物活性。因此，标准化的分离流程和定量方法对于外泌体质量和临床应用至关重要。

对于外泌体的保存条件来说，能够在体外保持外泌体的完整性也是极其重要的。一些研究表明，不同的储存条件可能会影响外泌体的大小，但对外泌体携带的货物没有太大影响。数据显示，在37°C下储存两天后，外泌体大小减少了约60%。4℃保存两天后外泌体大小基本保持不变，而3~4天后外泌体大小明显下降。有趣的是，外泌体的形态和大小在−20°C下保存可以保持一个月。迄今为止，仍缺乏证据表明外泌体可以在体外稳定保存很长时间，因此在体外维持外泌体完整性的挑战仍然严峻。

神经干细胞外泌体的生物学效应

神经干细胞分泌的外泌体参与了中枢神经系统中神经元与小胶质细胞之间的多种相互作用。此外，神经干细胞分泌的外泌体可将活性物质从神经元转移到星形胶质细胞，从而调节星形胶质细胞的功能、突触活动、神经血管完整性和髓鞘化。一方面，NSCs分泌的外泌体可将特定颗粒从原始细胞携带到靶细胞，导致病理变化加剧，如阿尔茨海默病（AD）中的淀粉样β蛋白（Aβ）和tau蛋白β、海绵状脑病中的朊病毒蛋白和帕金森病（PD）中的α-突触核蛋白。另一方面，神经干细胞外泌体可作为神经保护因子，促进周围神经再生和神经损伤修复。

神经干细胞外泌体治疗创伤性脑损伤的机制

先前的一项研究表明，神经干细胞有望成为实验模型和临床实践中TBI治疗的有效策略。然而，最近已经证明，神经干细胞与创伤性脑损伤后脑重塑和功能恢复相关的主要机制并不依赖于细胞替代效用，而是可能依赖于旁分泌效应，例如神经干细胞分泌的外泌体。

近期研究证实，神经干细胞外泌体作为信号分子的载体，参与介导脑损伤后病理过程中神经细胞的通讯，通过调节神经细胞间的信息通讯参与TBI后损伤的发生和修复。细胞。小RNA测序、蛋白质组学分析以及精选miRNA和蛋白质的验证证明，人iPSC衍生的NSC的外泌体富含参与促神经再生、抗凋亡、抗炎症、抗氧化作用、血脑屏障修复的miRNA和蛋白质此外，它们还含有促进突触可塑性和增强认知功能恢复的miRNA和/或蛋白质（图3）。

• NSCs分泌的外泌体含有多种细胞活性成分，可以自由穿过血脑屏障、抑制炎症反应和神经细胞凋亡、促进神经再生和血管生成等。
• 针对神经再生，NSCs分泌含有circAcbd6的外泌体，进一步促进NSCs的分化通过miR-320-5p/氧甾醇结合蛋白相关蛋白2轴进入胆碱能神经元。
• NSC衍生的外泌体含有抑制炎症反应、下调TNF-α、IL-1和IL-6等促炎因子表达并促进小胶质细胞从M1向M2表型极化的成分。
• 抗凋亡后，NSC分泌的外泌体转移miR-150-3p（一种富集的miRNA），并抑制神经元凋亡。NSC外泌体引起的自噬标记蛋白LC3B和beclin-1表达增加也减少了神经细胞的凋亡。为了促进血管生成，神经干细胞外泌体可以上调VEGF水平，从而加速血管生成。

工程神经干细胞外泌体针对脑损伤的潜在治疗作用

由于其独特的纳米结构、缺乏免疫原性、低毒性、良好的渗透性，具有穿越血脑屏障的能力，加之它们在组织再生、免疫等方面的重要作用，调控和疾病识别，外泌体在中枢神经系统损伤的治疗中具有巨大的治疗潜力，但天然外泌体的靶向能力较差，从而大大降低了治疗效果。

工程化外泌体具有主动靶向特定细胞类型和组织的能力。纳米技术的发展为靶向药物递送带来了新的希望，基于外泌体结构和功能的纳米制剂有望克服中枢神经系统障碍，将神经保护分子转移至脑实质，为针对脑区域的治疗提供有效的治疗手段中枢神经系统损伤疾病。

制备工程外泌体的策略之一是细胞工程。亲代细胞的基因工程是常用的细胞工程技术之一，即在外泌体生物发生过程中直接修饰外泌体。

外泌体工程学是即在适当条件下利用特定技术对纯化的外泌体表面蛋白或内容物进行修饰，主要分为孵育法、物理法、皂化法和表面修饰法。与细胞工程的低效率和高难度相比，直接修饰纯化的天然外泌体可以直接获得大量工程外泌体，减少细胞培养过程中的不确定性，对工程外泌体的大规模生产具有重要意义（图4）。

前景和挑战

与大多数外泌体类似，神经干细胞分泌的外泌体在脑损伤的治疗中具有以下优势。

• 首先，外泌体是纳米大小的囊泡，可以顺利穿过血脑屏障并且易于吸收，静脉注射后小血管闭塞的可能性非常低。
• 其次，外泌体负责细胞间的传递，当脑损伤发生时，内源性NSCs释放外泌体，向其他细胞传达需要救援的信息，实现受损大脑的修复和再生。
• 第三，NSCs分泌的外泌体具有低免疫原性，为神经系统疾病提供了一种无细胞疗法，且没有明显的副作用。
• 第四，与干细胞培养和保存的难度相比，植入后生长的风险无法控制，并且由于怀疑形成肿瘤，干细胞外泌体可以在制剂中储存并注射到血液中，很容易被利用吸收。

鉴于此，研究神经干细胞外泌体为优化基于细胞的疗法提供了见解，并有助于理解脑损伤后基于外泌体疗法的再生和修复的确切机制。

神经干细胞分泌的外泌体在再生治疗领域显示出前景，包括TBI的治疗。尽管TBI治疗中神经干细胞衍生的外泌体研究的数量不断增加且取得了有希望的结果，但临床前和临床研究的转化研究仍有很长的路要走。

目前，尚缺乏安全、有效、高产的外泌体生产和纯化方法，限制了外泌体用于疾病治疗的临床转化。因此，应深入探讨神经干细胞外泌体的纯化和保存方法标准，以确保获得高产量、高质量的外泌体，促进神经干细胞外泌体用于TBI治疗的临床转化。

尽管目前NSC外泌体的临床转化面临挑战，但除了基因修饰外，神经干细胞外泌体还可以与载药纳米粒子结合，发挥两者的优势，赋予神经干细胞外泌体未来更广阔的发展前景。

结论

总之，目前最有希望的脑损伤治疗方法之一是基于神经干细胞外泌体给药。由于大脑神经损伤后神经干细胞外泌体具有有益作用，因此有必要探索神经干细胞外泌体调节神经再生的潜在机制。

神经干细胞来源的外泌体治疗脑损伤的潜在机制可能是由于其神经再生、抗炎、血管生成和抗凋亡特性（图3）。此外，考虑到神经干细胞的工程化外泌体可能会在不同水平上影响脑功能，不同治疗途径（静脉内、鼻内或原位）的TBI疗效也有所不同。因此，根据TBI患者的需求定制神经干细胞外泌体治疗策略对于增强基于外泌体的无细胞疗法的效果至关重要。

参考资料：Zhong, L., Wang, J., Wang, P. et al. Neural stem cell-derived exosomes and regeneration: cell-free therapeutic strategies for traumatic brain injury. Stem Cell Res Ther 14, 198 (2023). https://doi.org/10.1186/s13287-023-03409-1

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