解放军总医院付小兵院士：提高间充质干细胞疗效，为临床提供满意效果！

作者：杭吉干细胞科技 医学编辑团队

• 内容声明：本文基于中国工程院院士、解放军总医院生命科学院院长付小兵教授团队发表的间充质干细胞预激活策略综述及公开文献撰写，仅供科普参考，不构成任何临床诊疗建议
• 利益相关声明：杭吉干细胞科技与解放军总医院及本文提及的任何机构无商业合作或利益关联
• 证据阶段说明：本文所述预激活策略绝大多数仍处于临床前研究或早期探索阶段，尚未形成标准化的临床应用方案，相关结论不应视为已确立的临床疗效

核心速读：基于间充质干细胞（MSC）的治疗被认为是针对多种难治性疾病的有前途的方法，但移植物植入不良、移植MSC存活率低、宿主年龄/疾病导致供体MSC潜能受损，使治疗结果仍不够令人满意。中国工程院院士、解放军总医院生命科学院院长付小兵教授团队发表综述，系统总结了当前MSC预激活的方法并进一步分类，分析了这些操作的科学原理和主要特点，并阐述了各种预激活策略的优缺点。

核心框架：预激活策略分为两大类——“生理微环境模拟预激活”（如缺氧、3D培养，旨在体外维持MSC的“年轻”状态和固有生物学特性）和“病理微环境模拟预激活”（如炎症因子、生长因子、生物活性化合物、疾病相关效应细胞或患者血清，旨在针对目标疾病的病理环境定制MSC功能）。与基因修饰相比，预激活是非基因修饰的替代路径，规避了病毒载体整合的肿瘤风险和免疫炎症反应，但预激活MSC的临床应用仍面临方法选择、MSC异质性、安全性评价标准缺失等挑战，绝大多数证据来自临床前研究。

解放军总医院付小兵院士：提高间充质干细胞疗效，为临床提供满意效果！

一、背景：MSC治疗的疗效瓶颈从何而来

基于间充质干细胞（MSC）的治疗被认为是针对多种难治性疾病的有前途的方法，因为MSC具有显著的多种效应，例如多向分化、免疫调节特性和促再生能力。

然而，移植物植入不良、移植MSC存活率低，以及宿主年龄/疾病下供体-MSC潜能受损，导致治疗结果还不够令人满意。多种不利条件将导致各种问题：

瓶颈	具体表现
移植细胞存活率低	暴露于缺氧、氧化应激及慢性炎症等恶劣宿主微环境，MSC可能很快发生凋亡
迁移和归巢差	限制了注射细胞的功能
个体间生物学效应差异	来自老年供体的MSC显示出增殖和分化受损、免疫调节抑制和生物活性分子分泌减少
肺微血管滞留	大多数输注的MSC滞留在肺微血管而不是靶组织中

二、两条增强路径：基因修饰vs预激活

尝试优化干细胞的策略大致分为两类，即基因修饰和非基因修饰（预激活） 。

基因修饰方面，MSC将产生或过量表达功能基因，使其能够抵抗不利的微环境和凋亡，增加迁移和归巢，并增强旁分泌效应。几项研究表明，基因转染的MSC比野生型MSC具有更好的治疗潜力。

然而，安全性是转基因MSC未来临床治疗应用的最大障碍。 据报道，病毒表达系统可以在宿主中引发免疫和炎症反应，并且病毒在宿主基因组中的整合会造成肿瘤风险。此外，基因工程MSC的治疗潜力和长期功能改善需要充分阐明。

因此，开发高效的非基因修饰方法（即预激活） ，是改善MSC治疗结果的一种替代和可操作的方法。MSC可以被预激活以实现所需的功能并逆转其失活，因为它们可以识别微环境中的刺激并记住它们。

回顾目前的文献，MSC的预激活主要分为两类：

预激活类型	核心逻辑
生理微环境模拟预激活	基于MSC存活的体内生理微环境，在体外模拟，旨在维持MSC的“年轻”状态和固有生物学特性
病理微环境模拟预激活	基于疾病的病理微环境，在体外对MSC进行适应性调节，使其适合目标疾病

三、生理微环境模拟预激活

原代培养的间充质干细胞数量有限。它需要在体外扩增以达到治疗相关的细胞数量，过度的离体操作导致衰老、干细胞减少和再生能力受损。

在体外保持MSCs的“年轻”是非常重要的。在这方面，在体外重建复杂的体内微环境将为MSC的生产提供一个强有力的工具，并保持其固有的生物学特性。低氧和三维(3D)培养是迄今研究得最深入的。

缺氧预激活

在体外培养条件下，MSCs通常暴露于平均氧分压约为21%的环境中。然而，间充质干细胞通常存在于低氧微环境中，其生理氧浓度在体内为1-11 %。

几项研究表明，高氧浓度在培养的MSCs中引起环境应激，然后诱导DNA损伤和衰老，并减少他们的活动。因此，缺氧是MSCs生理微环境的重要组成部分。

低氧预激活对间充质干细胞有多种有益作用。包括有：低氧培养环境维持MSCs的未分化状态。

低氧促进了MSCs的增殖和存活，与常氧状态(20% O2)相比，导致了更高的扩增和更多的ASCs产量，在体外迁移试验中，低氧预充促进了MSCs的动员，改善MSCs在体内的归巢。

低氧预充可以保护MSCs对抗不利的微环境，维持基因的稳定性。当暴露于低氧时，MSCs表现出延长的寿命并避免复制性衰老，与常氧培养相比，表达较少的衰老相关β-半乳糖苷酶。缺氧条件下的间充质干细胞表现出基因稳定性，DNA损伤减少，染色体畸变减少。

低氧培养后，MSCs的分泌模式发生变化，旁分泌功能增强。例如，在缺氧条件下，MSCs中促血管生成因子如VEGF、HGF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的分泌增加。相反，抗血管生成因子，如血小板反应蛋白-1和纤溶酶原激活物抑制剂-1，在间充质干细胞中减少。此外MSCs在低氧情况下的免疫抑制特性得到改善。

大量实验研究发现，低氧预激活的MSCs比未经处理的MSCs显示出更显著的治疗效果。在肺纤维化模型中，与常氧培养的MSCs相比，低氧预激活的MSCs可以明显减轻肺水肿，减轻肺纤维化，并改善肺功能。此外，与含氧量正常的骨髓间充质干细胞相比，将含氧量低的骨髓间充质干细胞移植入大鼠心肌梗死模型后，损伤部位的血管生成增加，梗死面积减小。

因此，与常氧的MSCs相比，缺氧预处理的MSCs表现出更好的特性并具有更好的治疗潜力。此外，低氧预激活具有简单、成本低、易于推广、适合大规模细胞生产的优点。然而，在低氧间充质干细胞进一步应用于临床之前，有几个问题需要解决。有必要优化低氧预激活中的氧浓度，因为MSCs生活的生理龛中的氧浓度因组织来源而异(骨髓中1%至7%，脂肪组织中10%至15%，出生相关组织中1.5%至5%)，此外，还应该揭示缺氧的最佳持续时间。更重要的是，生物安全是基于干细胞的治疗最关心的问题，在临床应用前应仔细确定。

3D培养预激活

与二维（2D）培养环境相比，三维培养系统模拟了体内的天然MSC微环境，并提供了增强的细胞间相互作用或细胞-ECM相互作用，可显著改善MSC的生物学行为，如增殖、免疫调节和定向分化。MSC的三维培养体系包括多细胞球体、支架和水凝胶。

球形培养：球体培养是一种相对简单的增强MSC生物学活性的方法，已开发出悬滴技术、低附着方法及强制聚集技术等。球体培养可使MSC去分化为更原始的状态（CD29、CD90、CD105下调，Sox2、Oct4、Nanog上调），改变分化偏好，提高增殖、迁移和归巢效率，并促进治疗因子的分泌。但球体大小的可变性影响MSC的治疗性能，在临床使用前需开发可重复的球体培养系统，并通过动物模型和临床试验确认安全性和有效性。

基于支架的培养：细胞外基质（ECM）是干细胞生态位的重要非细胞成分，被认为是干细胞的“土壤”。生物材料的最新进展促进了MSC人工ECM培养系统的发展。接种在工程化ECM支架上的MSC显示出抗炎调节因子PGE2和TSG-6的上调，以及MCP-1、IL-6和RANKL的下调。基于支架的三维培养赋予MSC比2D培养更优异的生物学活性和更突出的治疗效果。

四、病理微环境模拟预激活

MSC进入体内后即面临疾病导致的病理微环境，多种破坏性因素可导致移植细胞氧化应激和凋亡，并显著损害MSC固有的治疗特性。研究人员致力于针对恶劣环境微调细胞特性，使其适合目标疾病。基于MSC的可塑性和记忆能力，创伤微环境中的信号（如缺氧、炎症因子和细胞因子）是MSC体外操作的首要考虑因素。

需要特别指出：另一个值得关注的问题是，患者内源性MSC的生物学特性会随着疾病的发展而改变，表现出功能的丧失和下降。因此，改善MSC生物学活性、开发患者个性化的治疗性MSC具有重要意义。

4.1 炎症因子预激活

炎症因子和细胞因子的预激活被认为是模拟体内炎症微环境的最常见手段，在调节干细胞的免疫调节功能中发挥重要作用。

预激活因子	主要作用
TNF-α	在缺血和损伤组织中表达，通常用于模拟急性炎症环境
IFN-γ	MSC对IFN-γ有明显的免疫抑制反应，HGF、TGF-β1、IDO、前列腺素和COX-2表达增加，足以加强其免疫调节特性和治疗效果
IL-1β	增加MSC中许多粘附分子的表达
其他（IL-17A、IL-25、TLR配体）	作为替代预激活手段，获得了有希望的结果
联合促炎细胞因子	通过联合不同炎症细胞因子弥补较低效率，使治疗效果最大化

炎症细胞因子预激活不仅可以提高MSC抵抗氧化应激的能力，还可以在很大程度上增强MSC的免疫抑制特性。

用生长因子或再生细胞因子预激活间充质干细胞

用生长因子或再生细胞因子预充MSC是一种有吸引力的方法，如bFGF、SDF-1、SDF-1α、p38 MAPK等。用生长因子混合物预激活MSC显示了增强其生物学功能的协同效应。

但存在两个现实问题：①选择最佳的细胞因子来预激活MSC并赋予其所需生物学功能是重要步骤，是选择在各种疾病中共同变化的细胞因子，还是使用疾病特异性细胞因子，仍需深入研究；②细胞因子预激活的方法不够经济，因为大规模生产预激活的MSC需要大量的细胞因子。

用生物活性化合物预激活间充质干细胞

生物活性化合物是一种很有前途的预激活方法。目前用于刺激MSC的生物活性化合物根据来源可分为天然（如从中药中提取的）和合成化合物；根据其对MSC的生物学机制，可分类如下：

作用方向	代表性化合物
促进存活和迁移	曲美他嗪、他达拉非、阿托伐他汀、维生素E；中药或其提取物如丹参、姜黄素、迷迭香酸（RA）、gigantol等
增强免疫调节、旁分泌和治疗潜力	铁螯合剂去铁胺（DFX）、前列环素类似物曲前列环素、白藜芦醇（RSV）、补阳还五汤（BHD）等
逆转和修复受损MSC	抗氧化剂如n-乙酰半胱氨酸（NAC）、依达拉奉；表观遗传调控（部分重编程）；抗衰老药物如navitas（ABT-263）、槲皮素、达那唑、烟酰胺核苷、达沙替尼、二甲双胍

关于逆转受损MSC：随着体外大规模扩增，来自围产期组织的MSC将发生复制性衰老，来自老年供体的MSC普遍呈现早衰表型，来自患者的MSC表现出生物学功能的下降。拯救MSC的方法可广义地定义为降低细胞内氧化应激水平、通过表观遗传修饰重编程MSC，以及使用抗衰老药物等。 例如，达沙替尼和槲皮素的混合物可以减轻衰老细胞的负担，并改善重要组织如脂肪、骨、主动脉和脑的功能。

重要提示：MSC的衰老是一个非常复杂的过程，彻底了解衰老的潜在机制将有助于找到更有效的方法来恢复衰老的MSC。上述发现表明生物活性化合物具有改善受损MSC和修复衰老MSC的特性，但将其转化为临床仍需系统验证。

用疾病相关效应细胞或患者血清预激活间充质干细胞

“个体化MSC治疗” 是指通过体外预激活获得的MSC具有定制的功能，能够特异性地针对患者的疾病。作为基于MSC治疗的增强策略，直接使用效应细胞或其释放的活性物质作为预激活条件，而不是用典型的促炎因子、细胞因子或生物活性化合物进行教育。

疾病来源血清预激活的证据：Tang等人的研究表明，与注射对照血清预激活MSC的大鼠相比，注射中风血清预激活MSC的大鼠在脑缺血再灌注损伤模型中表现出明显改善的行为，炎症细胞因子减少，脑损伤和凋亡细胞减少，营养生长因子增加。在葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎大鼠模型中，用来自结肠炎大鼠或正常大鼠的血清预激活MSC后，前者在结肠炎大鼠中显示出更有效地阻止疾病进展、更好地改善临床特征以及更低的组织学损伤评分。

因此，疾病特异性预激活可能是实现“MSC定制临床治疗”的一种有前途的手段，而准确捕捉疾病特异性是这一策略的必要前提。

远景展望

除了通过重建生理和病理微环境来预激活间充质干细胞之外，还有其他方法来预激活间充质干细胞，包括光刺激、磁电刺激和热休克(HSP)等。

低水平激光疗法(LLLT)有利于调节多种细胞的生物功能。例如，与未受刺激的ASCs相比，受低强度激光刺激的ASCs的生物活性增强，表现为存活率增加、分泌增加和再生愈合加快。此外，最近证明脉冲电磁场通过调节Akt/Ras信号通路和上调Bad和Bcl-xL等存活蛋白对BMSCs起保护作用。此外，研究表明，热休克蛋白可以诱导细胞保护蛋白，增加抵抗不良外部环境的能力。

一般来说，现有的预激活方法的目的是充分利用MSCs的功能可塑性，并预先赋予MSCs所需的特性，以便当MSC再次遇到类似的环境时，启动细胞保护机制，快速激活反应机制，并迅速做出相应的生物反应。

尽管如此，预激活间充质干细胞的应用仍面临一些挑战。首先是选择合理有效的MSC预激活方法。

迄今为止，已经提出了许多补充方法来提高间充质干细胞的治疗效果，寻找最佳的预激活方法是我们未来研究的重要目标。每一个预处理的目标都是改善MSCs的一个特定方面，不同策略的最佳组合可以使MSCs的治疗效果最大化。

二是间充质干细胞的异质性，主要表现在两个方面：一是不同来源间充质干细胞的生物学特性在分化、表型谱和分泌谱方面存在差异，这意味着作为一种新型细胞药物，来自不同组织的间充质干细胞对同一疾病的治疗效果不一致。有必要深入了解每种组织来源的间充质干细胞的独特生物学特性，并结合不同的疾病模型来确定每种间充质干细胞的疾病营养特性。

第三是开发评估预激活间充质干细胞安全性和治疗特性的标准平台。大量研究证据证实，间充质干细胞主要依靠旁分泌发挥生物学效应。MSCs分泌产物的总和可视为分泌组，主要包含可溶性蛋白和细胞外小泡，其中前者包括细胞因子、趋化因子、生长因子，后者可分为外泌体和微泡(图1)。因此，准确地选择一种成分既作为预激活的指标又作为受教育MSCs的治疗效果的指标是一个棘手的问题。然而MSCs的体内生物学机制远比我们想象的复杂，一些抑制和对抗干细胞凋亡作为MSC预激活常用的评价指标是值得斟酌的。

初始间充质干细胞向预处理间充质干细胞向临床治疗转化的周期，预处理的间充质干细胞获得了良好的治疗效果，增强了损伤修复和疾病恢复。

最后，MSC体内治疗的本质是递送促修复调节因子和细胞外小泡等。因此，研究人员已经开始使用MSC衍生的可溶性蛋白质和细胞外小泡来替代干细胞进行治疗，其释放受到精确的调节，并且其组成随着预激活条件而变化。这种方法可以避免MSCs在体内增殖、分化和分泌不可预测的旁分泌因子的风险。最近的研究结果表明，通过密度梯度离心将MSCs去核为“无核细胞Cargocytes‘’，形成了一种生物启发的递送方法。Cargocytes保留旁分泌能力，不增殖，或永久移植在宿主体内。cargocytes的应用不仅避免了与直接使用MSCs相关的不良事件，如肺栓塞或脑栓塞，而且改善了生物分布并增强了体内靶向靶组织的能力。因此，来源于间充质干细胞的干细胞可能成为治疗载体，以可控和有效的方式传递具有治疗疾病潜力的治疗药物。

结论

总之，尽管预激活的间充质干细胞仍然存在问题，但由于其巨大的再生潜力，它们仍然为各种难治性疾病的治疗提供了相当大的希望。

迄今为止，越来越多的人一致认为，在各种病理条件下，预激活的间充质干细胞确实比未激活的间充质干细胞表现出更好的治疗效果。

今后，我们应该有效地利用“预激活”工具，一方面最大限度地发挥间充质干细胞的治疗潜力，另一方面将其改造为适合靶向疾病，为间充质干细胞的临床应用开启新的篇章。（本文由公众号“细胞PLUS”编译，转载请注明）

常见问题解答（FAQ）

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