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转基因神经干细胞移植治疗中枢神经系统损伤和神经系统疾病的进展

神经干细胞 (NSC) 越来越多地被认为是治疗中枢神经系统 (CNS) 损伤的细胞疗法最有希望的候选对象,这主要是因为它们具有多能分化能力以及出色的分泌和归巢特性。

近年来,人们开始广泛研究探索神经干细胞移植对中枢神经系统损伤的治疗潜力,并取得了重大进展。然而,由于损伤后形成不利的微环境,导致移植的NSC在宿主神经网络中的存活、分化和整合不理想,基于NSC的移植疗法往往无法达到最佳治疗效果。

为了应对这一挑战,基因改造已成为一种有吸引力的策略来改善NSC疗法的效果。这主要归因于它不仅可以增强NSC的分化能力,还可以促进一系列生物活动,例如分泌生物活性因子、抗炎作用、抗凋亡特性、免疫调节、抗氧化功能和血管生成。此外,基因改造使NSC在神经损伤的情况下发挥更强的神经保护作用

转基因神经干细胞移植治疗中枢神经系统损伤和神经系统疾病的进展

近日,在《Stem Cell Research&Therapy》杂志上发表了一项“转基因神经干细胞治疗中枢神经系统损伤和神经系统疾病的进展”的文献综述,研究人员探头了用各种治疗基因进行基因改造的神经干细胞在治疗神经损伤和神经疾病方面的作用和机制的最新进展[1]。

转基因神经干细胞移植治疗中枢神经系统损伤和神经系统疾病的进展

本综述首次对神经干细胞的特点、来源和有利于神经再生的特有基因改造,以及经过基因改造的神经干细胞在细胞治疗中对各种神经损伤和神经系统疾病的治疗能力进行了前所未有的全面分析。

此外,我们还详细总结了针对中枢神经系统损伤和疾病模型的基于基因改造的神经干细胞疗法的移植时机、途径和剂量的最新进展

我们相信这篇综述可以帮助更好地理解转基因NSC促进神经损伤修复的调控机制,并启发未来的实验研究,以更好地确定中枢神经系统损伤和疾病的治疗方案。

01什么是神经干细胞和转基因神经干细胞

神经干细胞的特点

神经干细胞(Neural Stem Cells,简称NSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的干细胞,它们在中枢神经系统(CNS)的发育和修复中扮演着重要角色。以下是NSCs的一些主要特点:

1. 自我更新和克隆扩增:NSCs可以通过对称分裂进行自我更新,保持干细胞池的大小,并通过增殖实现克隆扩增。

2. 多能分化:NSCs具有多向分化潜能,可以通过不对称分裂产生多种表型不同的神经元和神经胶质细胞,包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

3. 归巢能力:NSCs具有归巢能力,能够定向迁移到受损区域,这一能力与多种趋化因子和粘附分子的表达密切相关。

4. 神经分化:在动物早期发育过程中,NSCs可以被诱导分化,生成整个中枢神经系统。

5. 促进神经修复:NSCs能够通过多种机制促进神经修复,包括分泌神经营养因子和其他生物活性因子,改善不利的微环境,支持细胞存活,促进轴突再生,增强血管生成。

6. 治疗潜力:NSCs在治疗中枢神经系统损伤和神经退行性疾病方面具有巨大潜力,它们可以补充丢失的神经元,减轻神经损伤。

7. 年龄和区域特异性:在不同年龄段的哺乳动物大脑中,NSCs可以被吸引到距离神经退行性区域相当远的地方,显示出它们在不同年龄和脑区的分布和活性可能有所不同。

8. 细胞补充疗法:基于NSCs的治疗原则,细胞补充疗法被广泛认可,适用于对常规治疗反应不佳的中枢神经系统损伤患者。

9. 分泌活性:NSCs能够分泌多种产物,这些分泌物能够改善微环境,促进神经修复和再生。

这些特点使得NSCs成为研究和治疗中枢神经系统疾病的重要工具,尤其是在神经损伤和退行性疾病的治疗中。

神经干细胞的来源和位置

神经干细胞(NSCs)的来源和位置是神经科学研究中的重要领域,以下是NSCs的主要来源和位置:

1. 胚胎起源:NSCs起源于胚胎发育过程中的侧脑室壁内,包括皮质(Cx)、海马(Hp)、纹状体(St)、隔膜(SP)和脊髓中央管(SC)。

2. 成年哺乳动物大脑:脑室下区(SVZ):大多数成年神经干细胞位于海马齿状回的脑室下区。颗粒下区(SGZ):海马的另一个区域,也是成年神经干细胞的主要位置。

3. 嗅球(OB):成年啮齿动物和人类嗅球中也存在NSCs,它们可以产生中间神经元,并且有研究表明新生神经元从侧脑室的V-SVZ迁移到OB。

4.嗅粘膜:成年NSCs/神经前体细胞(NPCs)也可以从嗅粘膜中培养和表征,作为治疗神经损伤和神经系统疾病的替代来源。

5. 外源性NSCs:移植外源性NSCs是治疗神经系统疾病和损伤的一种有前途的策略,它们可以直接从胎儿和成人神经组织中分离,包括大脑和脊髓。

6. 多能干细胞转分化:NSCs可以通过将多能干细胞转分化获得,包括胚胎干细胞(ESCs)诱导性多能干细胞(iPSCs)。

iPSCs由成体细胞通过特定转录因子重新编程为多能状态获得。

7. 间充质干细胞(MSCs):源自MSCs的NSCs也被提议作为神经系统疾病的创新细胞治疗方法。

8. 转分化的体细胞:NSCs可以从转分化的体细胞中获得,包括血细胞中的单核细胞、皮肤成纤维细胞和尿液细胞。

9. 永生化NSCs:通过引入与胚胎发生相关的基因,NSCs可以进一步永生化,从而可以选择具有连续分裂能力的NSC克隆。

NSCs的这些来源和位置为研究和治疗中枢神经系统疾病提供了多种途径,包括细胞替代疗法和基因转移疗法。通过这些方法,科学家们可以探索NSCs在神经修复和再生中的潜力。

神经干细胞的起源和分化示意图
基因改造对神经干细胞在神经损伤中的生物学效应的详细说明。基因改造的NSC是特定分子的理想载体,可最大限度地发挥细胞治疗的潜力,并通过多种机制产生更高的治疗效率

我们为什么要研发转基因神经干细胞,转基因神经干细胞的价值

一、神经干细胞(NSC)临床应用面临的挑战

移植的NSC虽有通过补充受损或坏死细胞、旁观者免疫调节和神经营养机制发挥治疗作用的潜力,但临床应用面临巨大挑战,主要是移植的NSC存活率低且分化为神经细胞的效率低。脊髓损伤后,受损区域微环境恶化阻碍其增殖、迁移和分化潜力,影响治疗效果。并且直接递送神经营养因子等也存在如在血脑屏障渗透性有限、在神经组织内分布不充分、生物利用度低、半衰期短等问题。 

二、表观遗传修饰对神经干细胞的作用

表观遗传修饰在调节与神经发育和生长相关基因表达方面起关键作用,微小RNA(miR)作为关键的非编码调节RNA,在神经发生过程中有动态表达模式并启动多种功能,部分可作为病理状况的有效治疗靶点,已被用于增强NSC特性用于移植策略。像miR-124、miR-7b-3p等多个miR已被证实可通过不同机制增强NSC修复受伤或患病组织能力、改善神经功能、对抗中枢神经系统病变和神经系统疾病,通过多种表观遗传修饰对NSC进行调控代表着一种有前途的疗法。

三、组合基因工程技术与干细胞疗法的意义

神经损伤通常和炎症、细胞坏死等多种有害因素相关,增强NSC的抗炎、抗凋亡等能力对治疗中枢神经系统(CNS)损伤很关键。组合基因工程技术与基于干细胞的疗法提供了创新思路,特定基因转移到NSC中对治疗中枢神经系统疾病有有效性,常见传导的基因包含编码神经递质合酶、神经营养因子等的基因。

NSC作为传递治疗基因的极具吸引力的候选对象,基因改造的NSC不仅能促进细胞存活和增殖,还能增强向神经细胞的分化,移植后可维持特定分子高水平表达,改善微环境,减轻炎症等反应。 

四、转基因神经干细胞移植的潜在价值

转基因细胞的移植可能通过优化神经干细胞存活、增强神经元分化、促进轴突生长、可塑性和功能恢复等各种机制,为中枢神经系统损伤提供潜在更精准的治疗策略。

使用转基因神经干细胞移植治疗中枢神经系统损伤

转基因NSC/NPC的来源

用于治疗中枢神经系统损伤的转基因NSC/NPC的制备方法:

1. 分离自胚胎组织:多数NSC主要从胚胎的不同部位进行分离,比如胚胎14/14.5天的皮质、前脑、间脑、脊髓、海马,还有成人嗅觉系统等,这些部位的组织是获取NSC的来源之一。 

2. 永生化神经前体细胞系:像C17.2细胞系以及永生化人类NSC系HB1/F3,它们通过整合致癌基因实现无限增殖,凭借这一特性可进行大量生产,进而能为后续治疗应用等提供充足的细胞来源。

3. 来自胚胎干细胞(ESC)的NSC/NPC:胚胎干细胞也是制备NSC/NPC的一个途径,其具备相应的分化潜能等特点,可用于获取满足治疗中枢神经系统损伤需求的细胞。 

4. 来自骨髓基质细胞的NSC/NPC:骨髓基质细胞能够分化产生NSC/NPC,为中枢神经系统损伤治疗相关细胞的制备提供了别样的渠道。 

5. 诱导性多能干细胞衍生的NPC(iPSC-NPC):iPSC/NPC可以从患者自体皮肤成纤维细胞中产生,这一优势在于能够避免干细胞移植带来的免疫排斥和伦理问题,不过其在临床前应用面临着重编程效率低这一主要挑战,需要先解决该问题才能更好地投入应用。

转基因NSC/NPC移植的主要方法

目前对于脊髓损伤(SCI)治疗最有效的NSC移植策略尚未达成共识,不同移植方法在宿主体内会产生不同治疗结果,所以移植方法的选择要具备适应性,主要依据损伤的类型和严重程度来确定。 

不同神经损伤对应的移植方法

  • 创伤性脑损伤(TBI)移植策略主要是脑内移植,例如将细胞注射到同侧受伤半球。
  • 脊髓损伤(SCI)有多种移植途径,包括病变内(IL)注射,也就是直接把细胞注射到病变中心,或者注射到病变周围区域;还可采用鞘内(IT)给药、静脉注射以及脑室内注射(像将细胞送入脊髓)等方式。 
  • 出血性中风细胞移植主要是将细胞注射到上覆的皮质或同侧纹状体来进行。 
  • 缺血性中风移植涉及将NSC直接注射到同侧侧脑室、皮质和纹状体,这已被多项研究证实。 
  • 脑瘫是把悬浮在盐水中的NSC通过立体定向注射到大鼠左侧感觉运动皮质中,并且证明了其有效性。 

转基因NSC/NPC移植的最佳策略依旧取决于神经损伤的具体情况,需要根据不同损伤类型等因素灵活选择合适的移植方式来达到相对最佳的治疗效果。

转基因NSC/NPC移植剂量

虽然目前对于每次体内手术成功移植到病变部位的细胞数量尚无统一意见,但首次移植的细胞数量与神经损伤细胞疗法的疗效密切相关。

从临床试验角度,确定神经损伤的最佳移植细胞数量极为关键,移植细胞数量不足难以实现满意的神经修复治疗效果,而数量过多可能引发不良反应,像形成细胞凝块,遗憾的是当下干细胞疗法的细胞剂量还未确定。 

一、确定移植细胞数量的依据:目前使用转基因NSC/NPC确定移植细胞数量通常依靠临床前试验,而且动物种类、疾病模型、损伤持续时间和程度以及给药途径等方面的差异,都会对移植细胞数量的选择及最终结果产生影响。 

二、常见的转基因NSC/NPC移植数量范围及相关案例:通常,用于移植的转基因NSC/NPC数量大多处于2.5×10⁴至2×10⁶个细胞之间。

  • 比如在一项针对缺血性中风小鼠模型的特定研究中,设置了1×10⁵(低剂量组)和3×10⁵(高剂量组)个细胞的移植情况,结果显示移植后7天和14天,接受过表达SDF-1α的诱导性多能干细胞衍生的神经前体细胞(iPSC/NPC)的小鼠运动活动显著改善,不过低剂量组未观察到显著改善。 

鉴于上述情况,依据具体情形去探讨并优化用于神经再生的移植细胞数量是十分重要的。

转基因NSC/NPC的移植时机

一、确定移植时机的重要性:神经损伤包含一系列复杂的病理生理变化,所以确定神经干细胞(NSC)移植的最佳时机对于有效治疗脊髓损伤(SCI)等中枢神经系统损伤极为关键。

二、不同神经损伤类型对应的常见移植时机 

  • 脑创伤(TBI):先前动物研究主要在损伤后立即,或在损伤后24或72小时进行转基因NSC/NPC的移植。 
  • 脊髓损伤(SCI):细胞移植要么在损伤后立即开展,要么在损伤后每隔7或9天进行一次。 
  • 缺血性中风模型:通常在缺血再灌注后立即、6小时或3天进行细胞移植。 
  • 大脑中动脉闭塞(MCAO):移植在闭塞后2小时、1天、2天和7天进行。 
  • 脑出血:大多数研究选择脑出血后3天和7天作为移植时间点。 
  • 缺氧缺血性脑病模型:细胞在损伤后3天进行移植。 

三、移植时机的关键影响及总体要求

尽管目前没有研究系统地评估基于移植时机的NSC/NPC的效果,但细胞移植时机是影响细胞植入以及后续功能改善的关键因素。因此,针对中枢神经系统损伤的NSC输送时机应具备适应性,要根据不同损伤情况合理选择。

基因工程神经干细胞用于治疗创伤性脑损伤

创伤性脑损伤 (TBI) 是由外部机械力造成的一种毁灭性的神经系统疾病。它包括原发性损伤和继发性损伤,是全球45岁以下人群死亡和发病的主要原因。原发性损伤通常是由于最初的物理冲击(例如脑部受到撞击、打击或震动)导致脑区室立即受到机械破坏所致。

最近的研究表明,神经发生和突触形成的增强、轴突重塑和血管生成的诱导可显著改善实验性创伤性脑损伤 (TBI) 中的脑功能恢复。更重要的是,据观察,NSC可通过分泌神经营养因子、增加突触蛋白的表达以及分化为功能性神经元来促进TBI中的功能恢复。

因此,神经干细胞移植正在成为一种有前途的TBI治疗策略。令人鼓舞的是,通过针对性地修饰特定基因,转基因神经干细胞在治疗创伤性脑损伤 (TBI) 方面表现出比神经干细细胞更优的治疗效果(表1)

表1:多种基因修饰神经干细胞移植治疗创伤性脑损伤动物模型的示意图、移植时间、细胞数量及结果
表1:多种基因修饰神经干细胞移植治疗创伤性脑损伤动物模型的示意图、移植时间、细胞数量及结果

转基因NSC具有分化成神经元和神经胶质细胞的能力。值得注意的是,基因改造已被证明能显著提高NSC的存活率。此外,这些改造还能增加分化成神经元的NSC或NPC的比例。这种增强对于改善行为结果和促进TBI后运动功能的恢复至关重要。

基因修饰的神经干细胞用于脊髓损伤修复

SCI是对脊髓的一种毁灭性的神经和病理损伤,通常导致自主神经功能、感觉知觉和运动控制的暂时或永久性严重障碍。从病理生理学上讲,SCI的特征是最初是原发性损伤阶段,这会损害神经元和神经胶质细胞的完整性,随后是继发性损伤阶段,在接下来的几周内诱导进行性细胞凋亡和进一步的脊髓损伤。

尽管SCI的治疗策略取得了进展,包括药物干预、外科手术和康复努力,但这些方法只能有限地改善临床结果,目前尚无治愈SCI的方法。令人欣慰的是,细胞疗法代表了治疗SCI的一种有前途的方法。此外,生物材料的植入可以改善微环境,连接脊髓残端,并为轴突再生提供物理和方向支持。

目前,生物材料植入和细胞移植的组合疗法通过提高细胞存活率、调节细胞分化、为神经回路重塑和轴突再生提供方向支持,显著促进神经再生和功能恢复相比之下,基因改造的神经干细胞是治疗脊髓损伤的更有效方法。通过改变特定的分子表达,这些改造的NSC已显示出促进细胞存活和分化、促进轴突再生和髓鞘形成、减轻炎症、抵消细胞凋亡和减少胶质瘢痕形成等方面的更强功效

总的来说,通过移植基因修饰的NSC实现SCI后的神经功能恢复,主要归因于它们对 NSC增殖和存活、神经元和少突胶质细胞分化、轴突再生、抗凋亡和减少星形胶质细胞瘢痕形成的促进作用,以及内源性NSC的激活(见表2)。

表2:多种基因修饰神经干细胞移植治疗脊髓损伤动物模型的示意图、移植时间、细胞数量及结果
表2:多种基因修饰神经干细胞移植治疗脊髓损伤动物模型的示意图、移植时间、细胞数量及结果

基因改造神经干细胞在脑缺血治疗中的应用

卒中是全球第二大死亡原因,占全球死亡人数的5.2%。它也是导致残疾和认知障碍的主要原因,在发展中国家的患病率日益增加。大多数卒中是由于脑血管暂时或永久性阻塞引起的。缺血性卒中可导致脑梗死、脑组织坏死和局部神经元损伤,最终导致长期残疾甚至致命,从而每年在全球范围内造成巨大的经济负担。

近年来,神经干细胞移植已成为缺血性卒中一种有前途的神经修复方法,不仅通过提供结构替代,而且还通过神经营养支持、免疫调节和血管修复等机制产生有益作用。

其中,基因工程化的神经干细胞通过特定因子的过度表达选择性地修改其分泌蛋白组,从而在缺血性卒中的背景下发挥神经修复作用。这些影响通过增强移植细胞的存活和分化潜力、促进血管生成、减少梗塞体积、抑制细胞凋亡和减轻炎症来表现(见表3)目前,NSC的基因改造已不仅限于上调特定的生长因子和通路,还包括非编码RNA和整体SUMO化的参与,这些在缺血应激下维持细胞功能和体内平衡方面发挥着至关重要的作用。

表3:多种基因修饰神经干细胞移植治疗脑缺血动物模型的示意图、移植时间、细胞数量及结果
表3:多种基因修饰神经干细胞移植治疗脑缺血动物模型的示意图、移植时间、细胞数量及结果

本研究表明,移植转基因神经干细胞可显著减少缺血性中风的病灶体积,促进感觉运动功能恢复,改善认知功能障碍和行为缺陷,与非转基因NSC相比,效果更为显著。例如,移植过表达半乳糖凝集素-1 (Gal-1) 的NSC可减少梗塞体积,并减轻中风后至少28天内胼胝体和纹状体的白质损伤。

此外,转染Noggin的NSC已被证实可显著减少缺血皮质和齿状回的病理损伤,并改善神经系统评分。转基因NSC具有预防缺血性中风的潜在神经保护作用。增强移植细胞的增殖和存活对于其有效发挥功能至关重要

基因修饰神经干细胞治疗出血性中风

中风是最严重的疾病之一,其特征是严重后果,包括死亡和长期残疾。中风大致可分为出血性和非出血性两大类。出血性中风约占所有中风病例的20%,可进一步分为脑内出血 (ICH)、脑室内出血 (IVH) 和蛛网膜下腔出血 (SAH) 。其中,ICH是出血性中风最常见的亚型,治疗面临巨大挑战,影响全球数百万人。流行病学研究表明,ICH与死亡率增加和严重残疾有关。ICH的发生会引发一系列事件,导致原发性和继发性脑损伤,最终导致持续性神经系统功能障碍。

最近的研究表明,干细胞移植已成为再生医学领域治疗出血性中风的宝贵工具。相比之下,经过基因改造的NSC比未经改造的NSC表现出更高的治疗潜力。基于此,这些经过基因改造的NSC是治疗出血性中风的极有希望的候选对象(表4)。

表4:多种基因修饰神经干细胞移植治疗出血性中风动物模型的示意图、移植时间、细胞数量及结果
表4:多种基因修饰神经干细胞移植治疗出血性中风动物模型的示意图、移植时间、细胞数量及结果

为了解决出血性中风后的不良微环境,移植NSC中神经营养因子(如BDNF、VEGF、GDNF和各种生长因子)以及存活信号分子的过度表达已被证明能有效改善恶劣环境,从而促进细胞存活和神经再生。例如,过表达Akt1的NSC在移植到纹状体上皮时会广泛迁移到海马,这种基因改造显著提高了ICH后移植细胞的存活率

同样,与未经基因改造的细胞相比,移植过表达GDNF的NSC可使移植后第二周至第五周的细胞存活率显著提高。重要的是,大多数移植的转基因NSC会响应局部微环境的刺激而分化为神经元或星形胶质细胞。

基因修饰的神经干细胞用于治疗缺氧缺血性脑病

缺氧缺血性脑病 (HIE) 是一种因脑供氧不足而导致的脑损伤。新生儿期HIE的患病率明显升高,15%-20%的患儿在新生儿早期死亡,而幸存者则有严重的神经功能障碍,包括脑瘫 (CP)、认知障碍、癫痫、视觉和听觉障碍、行为问题、智力障碍和社会功能障碍。

最近,基于NSC的疗法已显示出对HIE的良好治疗效果,因其具有增强内源性脑修复机制的潜力而受到广泛关注。越来越多的动物模型研究表明,移植NSC可抑制神经炎症损伤,促进神经元重塑,并显著增强缺氧缺血性损伤后的行为功能。值得注意的是,应用基因工程技术,可以有效改变特殊蛋白质分子或表观遗传调控因子的表达,从而增强这些治疗效果。

结论与展望

一、NSC/NPC基因改造的积极作用

NSC/NPC的基因改造能够有意增强其增殖与存活能力,有效调节细胞分化途径以及分泌组,这有利于供体细胞和宿主细胞在氧化应激、炎症等不利条件下存活,并且有助于在如TBI、SCI、中风等各类损伤后创建内源性神经再生微环境,整合基因与干细胞疗法还有望克服单一治疗方法的局限,为神经损伤治疗和功能恢复带来更大益处。 

二、将基因改造的神经干细胞疗法转化为临床实践面临的挑战

  • 缺乏全面比较研究:在利用NSC/NPC进行转化和移植前,尚未针对来自各种干细胞来源的神经干细胞前体细胞(NSPC)展开全面且详细的比较研究。 
  • 胚胎组织来源的局限:当前对NSC的研究多聚焦于胚胎神经组织来源,然而移植人类胚胎组织来源的细胞无法解决伦理和道德约束等关键挑战。 
  • 肿瘤发生风险:由于特定基因整合到基因组中可能致使增殖能力增强,所以对NSC进行基因改造存在潜在的肿瘤发生风险。 
  • 缺乏全面指导方针:对于最佳移植时机、途径、细胞给药方法以及合适的细胞剂量,目前依旧缺少全面的研究以及统一的指导意见。 
  • 临床试验不足:当下的研究主要侧重于动物实验,临床试验数量不够,因而难以确定转基因NSC在人体中能否产生与移植后动物模型体内所观察到的相当的治疗效果,该方法的安全性、有效性以及潜在副作用都有待进一步深入研究。 

三、对神经干细胞移植基因转导治疗的展望

尽管神经干细胞移植基因转导治疗存在诸多固有挑战,但其独特优势和广阔潜力已备受神经再生领域研究人员关注。

鉴于神经干细胞移植疗法在临床应用方面的研究进展迅速,人们对转基因细胞疗法能够成功转化为临床实践抱有乐观态度,而且还可以依据损伤根本原因、损伤特征以及个体患者情况来制定专门的神经干细胞移植治疗策略。

参考资料:[1]:Tang, X., Deng, P., Li, L. et al. Advances in genetically modified neural stem cell therapy for central nervous system injury and neurological diseases. Stem Cell Res Ther 15, 482 (2024). https://doi.org/10.1186/s13287-024-04089-1

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五年随访数据证明:神经干细胞成为脊髓损伤治疗的可行选择
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