神经干细胞-祖细胞 (NSPC) 是多能、自我更新的细胞，可产生放射状胶质细胞 (RGC)。RGC 随后在神经发育过程中产生神经元和胶质细胞。在这里，我们描述了 NSPC 分离和培养以形成称为神经球的克隆聚集体的过程。本章概述了多种检测方法，使我们能够量化这些细胞的增殖、自我更新潜力和分化的差异[1]。

神经干细胞培养权威指南：NSPC高效提取与分化技术解析

1简介

在干细胞和祖细胞研究领域，了解控制神经生物学的复杂过程对于理解大脑内的功能通路至关重要。干细胞和祖细胞具有分化成神经系统内各种细胞类型的非凡能力，这使得它们对于研究神经发育和神经退行性疾病或创伤相关损伤的潜在治疗应用具有无价的价值。然而，理解控制其行为的潜在机制需要可靠且多功能的实验技术。

近年来，神经球测定法就是一项获得广泛认可的技术。该测定法最初 1992年开发，现已成为神经干细胞研究的基石。该测定法能够从中枢神经系统的不同区域（包括胚胎、胎儿和成人阶段）分离、扩增和表征神经干细胞。此外，该测定法还能检查干细胞和祖细胞对各种基因和药理操作的反应，为神经发育过程、神经再生和疾病建模提供有价值的见解。这些神经球由一群异质性细胞组成，其中包括神经干细胞和祖细胞，它们能够分化成中枢神经系统的主要细胞类型，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。通过利用特定的生长因子和培养条件，研究人员可以有效地维持干细胞和祖细胞的自我更新能力，促进其增殖并防止自发分化。

这项检测为研究干细胞和祖细胞神经生物学提供了许多优势。

首先，神经球检测可以大量扩增神经干细胞和祖细胞，同时保留其多能性。

其次，神经球检测提供了一种三维 (3D) 培养系统，更接近于体内微环境。神经球的3D特性为干细胞和祖细胞提供了支持性的“体外环境”，模拟了神经系统中的细胞相互作用和空间组织。

第三，神经球检测可以检查干细胞和祖细胞对各种因素和刺激的反应。通过调节培养基的成分，研究人员可以研究生长因子、小分子和其他生物线索对干细胞行为的影响。此外，该检测法还允许引入基因操作，例如基因过表达、缺失或敲低，以剖析干细胞和祖细胞神经生物学中涉及的分子通路。神经球检测法还提供了药物筛选和毒性测试的机会，有助于开发新的治疗策略。

最后，这些 NSPC 的分化能力也可以在体外建模，从而确定提取的细胞中特定的祖细胞群是否可能受到损害。

总之，神经球试验已成为了解干细胞和祖细胞神经生物学的宝贵工具。它能够扩增和维持多能细胞，具有3D培养环境，并且能够灵活地研究各种因素和疾病，使其成为揭示控制神经发育、再生和疾病进展的复杂机制的理想系统。

2材料

2.1 NSPC 分离和培养

• 1.磷酸盐缓冲液 (PBS)：配置10×溶液，将80gNaCl、2 g KCl、14.4 g Na ₂ HPO ₄加至 800 mL 蒸馏水。调节 pH 至 7.4 并加至 1 L。对于 1× PBS，将 100 mL 10× PBS 加至 900 mL 蒸馏水。
• 2.汉克斯平衡盐溶液（HBSS）。
• 3.神经球基础培养基（NSBM；1:1 杜氏改良伊格尔培养基 [DMEM] 和 F12、4 μg/mL 肝素、100 μg/mL 青霉素/链霉素）。
• 4.碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)。
• 5.表皮生长因子（EGF）。
• 6.B27（不含维生素A）。
• 7.低粘附性 6 孔组织培养板。
• 8.神经球解离溶液（50 mL HBSS、0.01 g EDTA、0.0125 g 胰蛋白酶 [0.25 mg/mL]、0.119 g N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸 [HEPES]，pH 值 8；以 1 mL 分装在 −20 °C 下冷冻，使用前立即解冻）。
• 9.中和溶液（50 mL HEPES 缓冲 DMEM、0.007 g 大豆胰蛋白酶抑制剂 [0.14 mg/mL]，以 1 mL 分装在 −20 °C 下冷冻，使用前立即解冻）。
• 10.60 孔 Terasaki 细胞培养板。
• 11.二甲基亚砜（DMSO）。

2.2神经球分化

• 1.8孔腔室载玻片。
• 2.聚-D-赖氨酸和层粘蛋白。
• 3.胎牛血清（FCS）。
• 4.4% 多聚甲醛 (PFA)：将 4 克 PFA 与约 70 毫升去离子无菌水混合。在 60 °C 下摇动溶解。溶解后，过滤 PFA，并用无菌去离子水加满至最终体积 100 毫升。
• 5.用于识别神经元 (小鼠抗 Tuj1) 和星形胶质细胞 (兔抗 GFAP) 的一抗。
• 6.二抗山羊抗鼠 555 和山羊抗兔 488。
• 7.4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)。
• 8.水性封固剂。

2.3逆转录病毒转导

• 1.0.5 M氯化钙。
• 2.稳定转导逆转录病毒gag和pol基因的人类胚胎肾 (HEK) 细胞 (HEK-293gp；病毒包装细胞系)。
• 3.含有 5% FCS 和100μg/mL青霉素/链霉素的 DMEM（DMEM/FCS/PS）。
• 4.60cm2个组织培养板。
• 5.DMEM补充有5-10%FCS和100μg/mL 青霉素/链霉素。
• 6.2× HEPES 缓冲盐水，pH 值 7.0 (HeBS)。
• 7.包含目的蛋白质的逆转录病毒载体（例如MSCV）。
• 8.水泡性口炎病毒糖蛋白（VSVG）包膜质粒。
• 9.5 mL 注射器和0.45μm注射器过滤器。
• 10.超速离心机和10mL超速离心管。
• 11._^水中重组纤连蛋白 (rFN)浓度为1mg/mL。
• 12.补充有2%牛血清白蛋白 (BSA) 的PBS。
• 13.24孔组织培养板。

3方法

3.1胚胎NSPC分离

• 1.在E14.5时对怀孕的母鼠实施安乐死，从子宫中收集胚胎，并立即放入含有冷 PBS 的培养皿中。
• 2.一次一个地去除胚胎的绒毛膜并除去胎盘（见注释1）。
• 3.解剖胚胎的头部，并在解剖显微镜下轻轻地将头骨从大脑中切掉。
• 4.接下来，沿矢状切开大脑，将其分成左、右半球。
• 5.去除每个半球的外部皮质，留下内侧、尾部和外侧神经节隆起（见注释2）。
• 6.一旦解剖，将神经节隆起放入含有5mL新鲜HBSS的15mLFalcon管中，放在冰上，直到所有大脑都被解剖（图1）。
• 7.在层流罩中，用移液器轻轻研磨以分解组织。
• 8.将分解的组织以1200×g的速度离心5分钟。
• 9.去除上清液并将细胞重新悬浮在5mL NSBM中，补充10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20ng/mL 表皮生长因子和 1:50 B27（不含维生素 A）。
• 10.将细胞转移到低粘附性6孔板中，使细胞形成克隆聚集体（神经球）。
• 11.在37 °C和5%CO₂条件下孵育细胞。

胚胎采集后，将脑从颅骨中取出 ( a )。接下来，去除皮质层，只留下外侧、内侧和尾部神经节隆起（分别为 LGE、MGE 和 CGE；b）。然后用移液器轻轻打碎，留下单细胞悬浮液 ( c )。培养后，GE 中的神经干细胞/祖细胞 (NSPC) 形成克隆聚集体，称为神经球 ( d )。这些可以分离（“传代”）成进一步的单细胞悬浮液 ( e ) 并重新接种，在那里它们将再次重新形成神经球 ( f )

3.2 NSPC文化

• 1.每2天取出2.5mL（一半体积）培养基（注意避免丢弃神经球；参见 注释 3）。
• 2.加入2.5mL新鲜NSBM，其中含有1:50不含维生素A的B27以及两倍浓度的 EGF 和 bFGF（20 ng/mL βFGF、40 ng mL EGF；称为 NSBM+2×GFs）。这将确保 GFs 的最终浓度保持在 1×。

3.3神经球解离和传代

• 1.维持培养直至大多数神经球变大，中心呈深色（约5-7天生长；图2）。培养基将开始变成橙色/黄色。
• 2.为了传代，将细胞转移到15mL Falcon 管中，并以700×g离心7分钟。
• 3.除去上清液并在室温下将神经球轻轻悬浮在 500 μL 解离溶液中3分钟，并轻轻研磨。
• 4.在室温下用500 μL中和溶液中和解离溶液3分钟，并轻轻研磨。
• 5.接下来，通过添加 8 mL NSBM 来清洗分离的细胞，然后在1300×g下离心5分钟 。
• 6.去除上清液并将细胞重新悬浮在 1 mL NSBM 中，进行细胞计数。
• 7.取所需数量的细胞（取决于所进行的分析；见下文）并加入5mLNSBM+1×GF。对于常规传代，细胞应以1–5 ×10⁵个细胞/毫升的密度接种。
• 8.将新传代的细胞放入6孔低粘附组织培养板的新鲜孔中，并在 37°C和5%CO₂下孵育。

正常神经球生长为自由漂浮的球体 ( a )；健康、活的神经球将呈现为中心呈深色的实心球 ( b )，而大多数细胞已发生凋亡或坏死的神经球将呈现松散和苍白 ( c )。可将健康神经球分离并以 5 个细胞/10 μL 的密度接种于 Terasaki 板中（每板 60 个孔）。接种后（2 小时）立即存在的活细胞数量可进行定量分析 — 大多数孔中将有 0 个或 1 个细胞（绿点；d）。培养 24 小时后，很少细胞会开始分裂，但有些细胞将发生凋亡（红色 x）。到 7 天时，任何具有自我更新潜力的细胞都将产生包含 >4 个细胞的神经球，而无潜力的细胞将发生凋亡。当在正常粘附板上生长时，神经球会粘附、长出突起（箭头），并开始分化（e）。然后可以使用免疫组织化学（f）检测，以可视化 Tuj1⁺神经元（红色）和 GFAP ⁺星形胶质细胞（绿色）占所有细胞的比例（蓝色细胞核；DAPI）

3.4累积细胞数测定

• 1.按照3.2节步骤2的步骤分离神经球后，计数细胞并以1-5×10⁵细胞/mL的浓度接种于 NSBM + 1 × GF 的低粘附性6孔板上。
• 2.每 2-3 天，移除培养基并更换为新鲜的 NSBM + 2 × GF。这将确保细胞继续在 NSBM + 1 × GF 中生长。
• 3.每7天，按照第3.2节步骤2进行细胞传代，并记录每周计数。根据神经球的健康状况，应重复此操作 5-6 周。

3.5神经球存活率测定

• 1.在 NSBM +1 × GF 的低粘附性 6 孔板上，每孔接种约 20-50 个第 7 天神经球。
• 2.计算存在的神经球的确切数量。
• 3.将神经球放置 14 天，不要更换培养基或重新添加生长因子。
• 4.计算由仍然存活的细胞组成的神经球的确切数量（图2）。

3.6克隆密度测定法测量不依赖于“体外微环境”的神经球形成

• 1.按照3.2节步骤2分离神经球，并对分离的细胞进行细胞计数。
• 2.将 1-2 × 10 ^{4 个}细胞放入 NSBM + 1 × GF 的低粘附性6孔板中，每孔培养。
• 3.每 2 天，取出培养基并用新鲜的 NSBM + 2 × GF 替换。这将确保细胞继续在 NSBM + 1 × GF 中生长。
• 4.第 7 天，计算已形成的神经球的数量。

3.7单细胞分析确定神经球形成潜力

• 1.按照3.2节步骤2分离神经球，并对分离的细胞进行细胞计数。
• 2.将细胞以 500 个细胞/mL 的浓度重悬于 NSMB + 1 × GF 中。
• 3.将 10 μL 细胞悬浮液分装到 60 孔 Terasaki 板的每个孔中。
• 4.统计 2 小时后每个孔中的细胞数。每个孔中应该有 0 或 1 个细胞；在极少数情况下，可能会看到 2 个细胞。
• 5.统计 24 小时和 48 小时时存在的细胞数量；一些 NSPC 可能已开始分裂。
• 6.在 48 小时时，向仍含有至少 1 个活细胞的孔中添加 10 μL NSBM + 2 × GF。
• 7.对已形成由≥4个细胞组成的神经球的孔数进行评分。

3.8分化试验定量神经源性潜能

• 1.准备8孔腔室载玻片，每个孔涂上150μL聚-D-赖氨酸 + 20 μg/mL 层粘连蛋白。这将确保 NSPC 能够粘附。
• 2.在室温下孵育 1 小时。
• 3.去除聚-D-赖氨酸+层粘连蛋白并用 PBS 清洗 2 × 5 分钟。
• 4.按照3.2小节步骤2解离 7 天培养的神经球，并对解离的细胞进行细胞计数。
• 5.以700×g的速度离心细胞7 分钟。
• 6.将细胞悬浮在补充有 1% 胎牛血清的500μL NSBM + 1 × GF 中。
• 7.将1×10⁵个细胞/孔放入 8 孔板中。
• 8.每 2 天取出培养基并替换为新鲜的 NSBM + 1 × GF + 1% FCS。
• 9.7 天后，在室温下用 PBS 中的 4% 多聚甲醛固定细胞 30 分钟。
• 10.接下来，用 PBS 中的 0.1% Triton X-100 对细胞进行通透 10 分钟。
• 11.通过在 PBS 中的 3% 牛血清白蛋白 (BSA) 中孵育细胞 30 分钟来进行阻断。
• 12.与鼠抗 Tuj1（在封闭溶液中稀释至 1:1000）（每孔 100 μL）一起在 4 °C 下孵育过夜。
• 13.用 PBS 清洗载玻片 2 次，每次 2 分钟，然后在室温下与山羊抗鼠 555 二抗孵育 30 分钟，在封闭溶液中稀释至 1:1000（每孔 100 μL）。
• 14.用 PBS 清洗载玻片 2 × 3 分钟，然后用 PBS 中的 4% 多聚甲醛在室温下固定 10 分钟。
• 15.用 PBS 清洗载玻片 2 × 3 分钟，并与兔抗 GFAP（在封闭溶液中稀释至 1:500；每孔 100 μL）在 4 °C 下孵育过夜。
• 16.用 PBS 清洗载玻片 2 次，每次 2 分钟，然后与山羊抗兔 488 二抗（每孔 100 μL）一起在室温下孵育 30 分钟，在封闭溶液中稀释至 1:1000。
• 17.先用 PBS 清洗载玻片 3 次，每次 2 分钟，然后在室温下用 PBS 稀释的 DAPI 孵育 5 分钟。
• 18.使用提供的腔室拆卸工具小心地取出介质腔室，然后使用剃须刀片或美工刀刮掉胶水。
• 19.然后将载玻片安装在水性封固剂中，并放置干燥过夜，然后进行成像（图2）。

3.9冷冻神经球

• 1.培养神经球直至其达到一定的尺寸和密度，表明它们已准备好通过。
• 2.从培养容器（例如烧瓶、培养板）中取出神经球，以 700 ×  g的速度离心7 分钟。
• 3.除去上清液并将细胞轻轻地重新悬浮在 500 μL NSBM + 2 × GF 中，其中含有 B27 的浓度为 1:25 而不是 1:50。
• 4.将神经球转移到冷冻管中并置于冰上。将 500 μL 20% DMSO（溶于 DMEM）加入冷冻管中并轻轻混匀。
• 5.冷冻管应立即放入冷冻保存容器中，以确保缓慢冷冻。冷冻后，应将样本放入液氮中保存。

3.10解冻神经球

• 1.将 NSBM + 1 × GF（每个样品 5 毫升）预热至 37 °C。
• 2.从液氮储存中取出冷冻管并置于 37°C 下快速解冻。
• 3.立即将解冻的神经球转移到预热的培养基中，并以 700 ×g的速度离心7 分钟。
• 4.除去上清液并将神经球轻轻悬浮在 5 mL 新鲜 NSBM + 1 × GF 中。

3.11逆转录病毒转导

• 1.将HEK-293gp细胞放入60cm ²培养板中的DMEM/FCS/PS中，培养直至汇合率达到约90％。
• 2.将 500 μL 2 × HEPES 缓冲盐水（pH 7.0）（HeBS）加入到 10 mL 聚丙烯管中。
• 3.将 10 μg 质粒/板与 10 μg/板水泡性口炎病毒糖蛋白 (VSVG) 包膜质粒和 0.5 M CaCl ₂相结合，最终体积为 250 μL，用无菌 H ₂ O溶解。
• 4.将质粒/VSVG 混合物逐滴添加到 HeBS 中，同时使空气通过 HeBS 起泡（例如，使用移液器或类似设备）。
• 5.将反应混合物在室温下孵育 20 分钟。
• 6.逐滴加入HEK-293gp细胞中并在37°C、5%CO 2下孵育24小时。
• 7.取出培养基并替换为 10 mL NSBM。
• 8.将细胞在 37 °C、5% CO 2条件下孵育 72 小时。
• 9.从孔中取出细胞并以 1400 ×g的速度离心5 分钟。
• 10.通过 0.45 μm 注射器过滤器过滤上清液以去除细胞碎片。
• 11.将上清液放入超速离心机，以 25,000×g的速度离心 90 分钟，以浓缩逆转录病毒。
• 12.取出 9.5 mL 上清液，轻轻将逆转录病毒颗粒悬浮于 1 mL 新鲜 NSBM 中。病毒可以 500 μL 等分试样形式储存于 −70 °C。
• 13.将 19 μg rFN 涂在 200 μL PBS 中的 24 孔组织培养板中的单个孔中，在 4 °C 下至少放置 16 小时。
• 14.在室温下用 400 μL PBS + 2% BSA 清洗每个孔 30 分钟。
• 15.在室温下用 2 mL PBS 清洗 2 次。
• 16.向每个孔中添加 500 μL 逆转录病毒上清液，并在 32°C 下以 1500× g的速度离心 60 分钟，以促进逆转录病毒颗粒与 rFN 结合。
• 17.按照3.2小节步骤2解离神经球，去除病毒上清液，并将 5×10⁵个NSPC（含 NSBM + 1 × GF）接种到每个孔中（见 注释 4）。
• 18.培养24h，除去NSBM，加入500μL神经球中和液。
• 19.孵育 3 分钟，用移液器轻轻研磨细胞，并转移到 15 mL 管中。
• 20.以1300 ×g的速度离心5 分钟。
• 21.除去上清液，将细胞悬浮在 2 mL NSBM + 1 × GF 中，并转移至超低附着6孔板（见注释5）。
• 22.按照小标题3.2所述培养神经球。
• 23.如果逆转录病毒含有荧光标记，则使用荧光显微镜观察成功感染的神经球（图3）。

神经球（此处显示为 20 倍和 40 倍）生长 7 天，分解，生长为单层，感染逆转录病毒，并重新形成神经球。在明场光学系统（a、b）和蓝光（c、d）下检查这些神经球，以识别 GFP+ 神经球。还显示了合并的照片（e、f）

4注

1.将每个胚胎放在单独的培养皿中解剖。如果需要对胚胎进行基因分型，则取出一小块肢体组织、剩余的大脑或卵黄囊，以便随后提取 DNA 并进行基因分型。

2.神经节隆起 (GE) 很容易被识别，因为它们在明视野显微镜下看起来比上面的皮质层更暗。

3.为了避免在更换一半培养基时丢失神经球，请轻轻旋转培养板以收集每个孔中心的神经球（特别是对于>7 天的神经球）。然后可以从边缘去除培养基，以确保神经球损失最小。

4.将神经球接种到这些培养皿中，可使神经干细胞以单层培养物（而不是漂浮的神经球）的形式生长，而不会诱导分化。单层培养将大大提高该技术中逆转录病毒的感染效率。

5.使用含有荧光报告基因的质粒非常有益，因为可以使用荧光激活细胞分选 (FACS) 分析确定阳性细胞和感染效率。

参考资料：Gasperoni, J., Dworkin, S. (2024). Neural Stem/Progenitor Cell (NSPC) Extraction and Culture. In: Dworkin, S. (eds) Neurobiology. Methods in Molecular Biology, vol 2746. Humana, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3585-8_9

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