脑移植排斥难题攻破！双药合璧，异种神经干细胞移植存活率翻倍

中枢神经系统 (CNS) 疾病，包括中风、阿尔茨海默病、帕金森病和脊髓损伤 (SCI)，可导致残疾和死亡，每年影响数百万人 。然而，目前尚无治愈性疗法来阻止或逆转其进展。神经干细胞 (NSC) 移植由于其能够分化为各种神经元和神经胶质细胞类型且肿瘤发生风险极小，可能成为中枢神经系统疾病的下一代治疗替代方案。

近日 ，国际权威期刊杂志《Transplant Immunology》发表了一项“在脑内鉴定同种异体及异种神经干细胞的免疫原性以及减轻移植排斥的策略”的研究[1]。

在这项研究中，我们展示了同基因、同种异体和异种神经干细胞移植引发的神经炎症反应，并评估了环孢素A（CyA）和甲泼尼龙（MP）对移植物排斥的免疫抑制作用。

研究结果显示，异种神经干细胞移植诱导了中性粒细胞、小胶质细胞 / 巨噬细胞、CD4+和CD8+T细胞的浸润，而同种异体移植主要触发小胶质细胞/巨噬细胞的募集。两种移植类型均导致移植细胞数量急剧下降。CyA和MP的联合治疗显著减轻了异种免疫排斥反应，并显著增加了脑内存活的移植细胞数量。同样，MP单一疗法有效降低了同种异体排斥反应，提高了移植细胞的存活率。

总体而言，同种异体神经干细胞移植主要触发先天性免疫，而异种移植则引发先天性和适应性免疫反应。因此，异种移植需要CyA和MP联合治疗，而MP单一疗法可减轻同种异体移植中的排斥反应。我们的研究结果可能为减轻脑内同种异体和异种神经干细胞移植排斥提供了一种策略，从而为各种中枢神经系统疾病的临床前和临床应用中基于神经干细胞的治疗优化微环境。

为什么要进行这项研究？目前干细胞治疗神经中枢神经系统疾病的主要挑战是什么？

目前基础和临床研究发现，源自成人人体的神经干细胞（ahNSCs）在啮齿类动物模型中对中风、阿尔茨海默病和脊髓损伤显示出积极的治疗作用。

然而，将干细胞疗法应用于患者仍面临诸多挑战，包括细胞存活率低、人与啮齿类动物免疫系统的差异，以及移植排斥反应。许多研究发现，免疫反应和移植排斥会导致移植物损伤并恶化其功能。此外，啮齿类动物模型与人类患者移植后的免疫反应存在显著差异，这可能是许多临床前研究未能转化为人体试验或大型动物模型的原因。

因此，降低移植排斥可能有助于移植细胞的存活和发挥疗效，并在啮齿类动物与人类之间创造相似的免疫环境。

免疫抑制剂已成功用于预防器官移植中的同种异体排斥反应，也可能提高干细胞的存活率。在我们及其他先前的研究中，环孢素A（CyA）被用于改善移植ahNSCs的持久性，但其抑制效果并不理想。此外，许多研究表明，将作用机制不同的免疫抑制剂联合使用，对干细胞治疗的效果优于单独使用CyA。

因此，为延长移植物存活并为移植创造一致的免疫环境，可针对每种移植类型和实验条件选择最佳的免疫抑制剂组合。在多种免疫抑制剂中，甲泼尼龙（MP）作为一种对先天性免疫系统具有广泛抗炎作用的糖皮质激素，与抑制T淋巴细胞介导免疫反应的CyA，可能是理想的联合用药选择。

本研究评估了同基因、同种异基因和异种神经干细胞移植入脑后在体内诱导的免疫应答的差异。基于这些免疫学差异，分别在同种异基因和异种NSCs移植中，分别单独或联合使用CyA和MP以最大限度延长移植物存活，并研究其对脑内移植免疫应答的影响。

什么是异种神经干细胞移植：简单来说，异种神经干细胞移植就是“把人的神经干细胞种到动物脑子里”，用于模拟人类细胞治疗，但因物种差异会引发猛烈排斥，是药物开发和再生医学研究中的重要工具模型。

神经干细胞的特性

细胞来源与移植验证：本研究使用了三种来源的神经干细胞（NSCs）：C57BL/6小鼠胎脑（B6NSC，图1A、B）、ICR小鼠胎脑（ICRNSC，图1C、D）和成人颞叶（ahNSC，图1E、F）。

通过H&E染色证实，这些细胞被成功移植到免疫活性C57BL/6小鼠的纹状体内。与仅注射缓冲液（出现组织损伤且无细胞团）的对照组不同，注射了三种NSCs的组（同基因B6组、同种异体ICR组、异种ahNSC组）均在注射部位形成了明显的细胞团。同种异体ICRNSCs和异种ahNSCs的成功移植还分别通过其特异性标志物H2Kd和STEM121分别证实移植成功，表明各组NSCs均已正确注射至纹状体。

核心特征与分化潜能：无论来源如何，所有三种来源NSC均表达NSC特异性标志物巢蛋白和增殖标志物Ki-67（图1A、C、E）。在未分化状态下，一些NSC表达分化的神经细胞标志物，包括Tuj1（神经元）和GFAP（星形胶质细胞）（图1A、C、E）。

分化后，NSC失去了巢蛋白和Ki-67的表达，而显示出发芽和延伸的神经突，即分化神经细胞的形态（图1B、D、F）。此外，一些细胞强烈表达Tuj1、GFAP、Olig2或O1（图1B、D、F）。Olig2和O1是少突胶质细胞的特异性标志物。这些特征（巢蛋白/Ki-67表达、分化后特定标志物表达和形态变化）共同证实了所用细胞是具有多向分化潜能的神经干细胞。

大脑对移植神经干细胞的免疫反应

为评估大脑对不同来源移植神经干细胞（NSCs：同基因B6、同种异体ICR、异种人类NSCs分别代表自体、同种异体、异种移植）的免疫反应（图2），研究将细胞注射到C57BL/6小鼠基底神经节，并监测至移植后6天。

免疫组化分析显示，所有移植组均出现CD45阳性白细胞逐渐增加（图2A），其中异种移植组在移植后第4天和第6天的白细胞数量显著高于其他组，同种异体移植组在第6天也显著高于对照组（仅注射缓冲液）。类似增加模式也见于中性粒细胞（图2B）、小胶质细胞/巨噬细胞（F4/80（图2C）+、Iba-1（图2D））以及T细胞（CD8-（图2E）、CD4+（图2F）），尤其异种移植组的中性粒细胞（移植后2-4天）和T细胞（移植后4-6天）激增最为显著。

结果表明，脑内注射本身即可激活先天免疫（如中性粒细胞、小胶质细胞/巨噬细胞），同种异体移植会加剧此反应，而异种移植则在先天免疫激活后，于移植后1周内进一步引发了适应性免疫反应。

此外，当利用针对人类细胞质的免疫组织化学（IHC）检测受体小鼠脑内的人类神经干细胞（图S2）以及利用人类特异性序列HS C2N4的PCR检测（图2G、H）时，发现人类细胞逐渐减少。这与免疫系统的激活相反，提示免疫反应可能影响移植神经干细胞的存活。

免疫抑制剂对异种神经干细胞存活的影响

为评估免疫抑制剂对异种（人类）神经干细胞（NSCs）移植后免疫反应和细胞存活的影响，研究使用了靶向先天免疫的甲泼尼龙（MP）和靶向适应性免疫的环孢素A（CyA）。

免疫组化（IHC）显示，全身性给予MP或CyA+MP组合，在异种移植后1周至3周期间，能显著减少大脑中CD45阳性浸润白细胞的数量（图3A）。然而，在CyA组中并未观察到这种影响 (图3A)。在异种移植后第2周，CyA+MP组与MP单一疗法相比表现出明显更高的效力 (图3A)。虽然免疫抑制剂在中性粒细胞中的作用不明显（图3B），但在F4/80（图4A、B）或Iba-1阳性的小胶质细胞/巨噬细胞（图4C、D）以及CD8（图5A、B）或CD4（图5C、D）阳性T细胞群中均观察到CyA和MP的免疫抑制作用，然而CyA组的CD8阳性T细胞数量也显著减少（图5A、B）。

此外，研究通过免疫组化（IHC）和PCR检测发现，联合使用环孢素A（CyA）和甲泼尼龙（MP）进行免疫抑制治疗，在移植后第1周显著提高了受体小鼠大脑注射部位人类神经干细胞（NSCs）（图6A、B）的存活数量及其特异性基因（HS C2N4）（图6C、D）的表达水平；虽然在移植后2-4周，注射部位核心区细胞显著减少，但在其周边区域检测到了更多人类NSCs（图6E、F），说明移植的人NSCs迁移到附近的脑实质中。总之，结果表明，先天性和适应性免疫的双重抑制可能为移植的异种移植细胞在脑内的存活创造更有利的环境。

免疫抑制剂对同种异体神经干细胞存活的影响

在神经干细胞（NSCs）的同种异体移植中，大脑中激活了先天免疫（图2）。因此，通过免疫组化（IHC）分析了靶向先天免疫（MP）和/或适应性免疫（CyA）的免疫抑制剂的效果。

免疫抑制效果：在同种异体神经干细胞移植模型中（与异种移植不同），单独使用靶向适应性免疫的环孢素A（CyA）、单独使用靶向先天免疫的甲泼尼龙（MP）以及两者联用（CyA+MP），在移植后1-3周均能显著减少脑内CD45阳性浸润白细胞的数量（图7A、B），其中联合用药在第2周的效果显著优于任一单药。

虽然中性粒细胞数量未受显著影响，但这些免疫抑制剂也能有效抑制小胶质细胞/巨噬细胞（F4/80+（图8A、B）、Iba-1+（图8C、D））的激活。特别值得注意的是，移植后第3周出现了T细胞（CD8+、CD4+）数量的意外增加（图9），而所有免疫抑制剂治疗方案都能显著抑制此反应，这表明同种异体移植引发的T细胞反应具有延迟且短暂的特点。

细胞存活与分布：免疫组化分析显示，在注射部位核心区域，各用药组与对照组之间存活的同种异体神经干细胞数量没有显著差异（图10A、B）。然而，在注射部位的周边区域，接受MP单药或CyA+MP联合治疗的组中，检测到的存活同种异体神经干细胞数量显著多于对照组，且MP单药与联合用药组在此区域的效果相当。这表明免疫抑制治疗（尤其是针对先天免疫的MP）更有利于移植细胞在注射点周围脑组织中的存活或扩散。

神经干细胞移植治疗神经系统疾病的核心机制与免疫排斥挑战

NSCs治疗神经系统疾病的核心机制在于其免疫调节和神经营养旁分泌活性，这高度依赖移植细胞的存活。尽管大脑具有免疫豁免特性，但移植排斥仍是限制NSCs存活和功能的关键障碍。临床前（动物模型）和临床（患者）研究中观察到的不同免疫反应模式，阻碍了成人源NSCs（ahNSCs）研究的转化，凸显了研究并抑制脑内移植排斥的重要性。

同基因、同种异体和异种NSCs体内移植会引起的脑内免疫反应差异？

免疫反应强度与模式差异：研究评估了三种神经干细胞移植（同基因、同种异体、异种）后大脑的免疫反应，发现异种移植引发最强烈的排斥反应（尤其炎症细胞浸润最多），同种异体移植次之。免疫细胞浸润呈现时序性：异种移植中，中性粒细胞最早（立即至2天）并强烈浸润，随后巨噬细胞/小胶质细胞（4-6天）和T淋巴细胞（4-6天）依次增加，此模式与同种异体胰岛移植的长期免疫反应阶段划分相似。

同种异体移植特点与基线免疫激活：与异种移植不同，同种异体移植主要激活先天免疫（显著的小胶质细胞/巨噬细胞浸润），而中性粒细胞和T淋巴细胞早期（6天内）浸润与自体移植无差异；T细胞浸润延迟至移植后第3周出现，但短暂且第4周消退。此外，阴性对照（仅注射缓冲液）和同基因组也观察到先天免疫细胞（CD45+白细胞、中性粒细胞、小胶质/巨噬细胞）浸润，表明注射操作本身即可触发先天免疫反应，可能影响所有类型移植（包括同基因）细胞的存活。

同种异体移植与异种干细胞移植的免疫抑制剂效果与局限性有哪些？

同种异体移植：针对先天免疫的MP单药或联合CyA+MP均能有效减少CD45+白细胞及小胶质/巨噬细胞浸润，显著提高移植细胞在注射点周边组织的存活率。单独使用针对T细胞的CyA效果不佳，支持了同种排斥主要依赖先天免疫的观点。

异种移植：需要同时抑制先天和适应性免疫。CyA+MP联合方案在减少多种免疫细胞（CD45+白细胞、T细胞、小胶质/巨噬细胞）浸润和提高早期（1周）细胞存活率方面效果最佳，并能促进细胞向周围脑组织迁移。但即使联合用药也无法完全消除排斥，提示存在其他未被阻断的排斥通路。

影响神经干细胞存活的其他关键因素与研究意义

NSCs存活还受多种非免疫因素影响，如：移植细胞形态（神经球优于单细胞）、移植部位（海马优于纹状体）、疾病模型/微环境（影响最佳移植时间窗）、宿主营养支持以及注射操作导致的BBB破坏（使细胞更易被识别）。免疫抑制疗法被证实对提高同种和异种移植物的存活是必要且有效的。

研究结论指出：我们证明异种NSCs移植在脑内引发了最强烈的免疫反应，触发了先天性和适应性免疫反应，而同种异体NSCs移植主要引发先天性免疫反应。鉴于此，在以异种移植为主的非临床试验中，CyA和MP联合应用效果最佳；而在以同种异体移植为主的临床试验中，单独使用MP的疗效与联合应用相当。

我们的研究或可为减少脑内神经干细胞移植排斥反应提供方法，并为NSCs治疗各种中枢神经系统疾病后的临床前和临床研究创造最佳环境。

主要参考资料：

[1]:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966327425000759?via%3Dihub#f0050

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