提高间充质干细胞治疗呼吸系统疾病的效果的方法有哪些？

由于具有抗炎、抗凋亡、抗菌和抗纤维化特性，间充质基质细胞 (MSC) 被认为是治疗呼吸系统疾病的一种有前途的替代方法。尽管 MSC 给药已在临床试验中被证明是安全的，但迄今为止，很少有研究表明MSC对呼吸系统疾病有效。

提高间充质干细胞治疗呼吸系统疾病的效果的方法有哪些？

本综述介绍了增强MSC有益作用的策略，包括预处理（在缺氧、氧化应激、热休克、血清剥夺和暴露于炎性生物样品下）和基因操作。这些策略可以通过诱导细胞保护基因的表达来不同程度地促进MSC存活率的提高，并通过改善修复因子的分泌来提高MSC的效力。此外，这些策略已被证明可以增强MSC在临床前肺病模型中的有益作用。然而，要将这些策略从实验室转化为临床，还有很长的路要走。

间充质干细胞在治疗呼吸系统疾病中的潜力

间充质基质细胞（MSC）处于再生医学领域前沿。其有明确特征，人类MSC培养时会粘附在塑料上，表达特定细胞表面标志（如CD105、CD90、CD73），缺乏另一些标志（如CD45、CD34、CD14），且在诱导剂存在下能体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。过去十年还证实其具备免疫调节特性，可抑制多种免疫细胞（巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞以及B和T淋巴细胞）的增殖、成熟和分化。

MSC通过多种机制减轻炎症，

• 一是通过在细胞外囊泡等部位分泌旁分泌/内分泌介质（如激素、细胞因子、生长因子等），这些分泌因子有抗炎、抗凋亡等多种活性；
• 二是借助细胞间接触，靠配体与受体识别影响免疫细胞；
• 三是通过细胞器转移（如线粒体）来发挥作用。

鉴于上述机制，MSC被视作肺部疾病（如急性呼吸窘迫综合征、过敏性哮喘、肺气肿、矽肺病等）的潜在疗法，相关临床前研究中展现出的有益作用推动了临床试验开展。虽然临床试验表明其安全性良好，但MSC治疗的潜在功效有限，这可能是受接种量少（图1a)、在肺部疾病病程晚期给药、体内存活率低（图1b）以及效力/生物活性受损（图1c）等多种因素影响。

a：接种的MSC数量少。此外，尽管MSC在全身给药后很容易被困在肺毛细血管中，但无法长期保留。因此，修复因子的数量逐渐减少。

b：MSC易受炎症微环境毒性的影响，导致体内存活率低。剩余的少数存活MSC可能不足以发挥足够的治疗效果。

c：尽管MSC存活且数量充足，但它们的效力可能仍然较低，即缺乏减轻炎症或修复受损组织的活性或有效性。

MSC在肺部的植入是细胞治疗面临的一大阻碍，据估算，MSC在24小时内就会从肺组织中被清除。目前主要测试了两种解决该问题的策略：

一是让MSC过表达表面受体CXCR-4，其能与基质细胞衍生因子1相互作用，以此支持MSC归巢至受损部位，使得在急性肺损伤模型中，更多MSC可进入并定居肺部；

二是采用磁靶向技术将MSC募集到肺组织中，不过该技术虽能提高48小时后的细胞保留率，但其有效性尚未得到确切评估。

另外，为提高MSC的存活率或效力以增强其有益作用，也提出了两种策略。

其一是预处理，它以生物学兴奋效应概念为基础，即让MSC短暂接触低剂量的有毒或致命药剂来产生有益效果（如应激耐受性生长或长寿）；

其二是基因操作，通过质粒转染、病毒载体转导或运用miRNA、小干扰RNA（siRNA）来对参与细胞存活途径和免疫调节的基因进行调节。

而本综述旨在描述并讨论上述这些策略，以及它们在实验环境中是怎样对肺部疾病治疗起到促进作用的。

提高间充质干细胞存活率的策略

MSC疗法要想成功，需要有合适数量的细胞，为此会在含富含生长因子的动物血清的培养基里对MSC进行体外扩增。但连续复制、培养条件以及冻融等情况可能会给细胞带来损害，导致它们在面对受损组织的恶劣环境时更为脆弱。

近期有数据表明，新鲜解冻的MSC可能无法具备与新鲜培养的MSC相同的效果以及抗炎活性范围，不过也有研究小组报告称，在实验性过敏性哮喘中，解冻的MSC和新鲜培养的MSC效果一样。

所以，还需要进一步深入研究，去评估新鲜和解冻的MSC在不同疾病模型以及不同体内环境下的有效性情况。 预处理策略已经被拿来测试，目的是保护MSC免受受损环境影响，进而提升其存活率。部分研究聚焦于MSC在亚致死性暴露于细胞应激源（比如缺氧、高温、营养耗竭等）时的反应（图2），这些应激源与缺血或炎症微环境类似，它们被视作是体内细胞存活面临的主要挑战。

除了预处理外，还尝试操纵与重要细胞周期、细胞凋亡和细胞存活途径有关的基因，以尝试提高MSC存活率。例如，过表达肝细胞生长因子 (HGF) 的MSC在体内表现出存活率提高，其效果已在肺损伤模型中得到测试。

提高间充质干细胞存活率的预处理策略

缺氧预处理

缺氧预处理能够让 MSCs 在缺血性微环境中存活，对于治疗与气体交换障碍（如急性呼吸窘迫综合征、肺气肿、哮喘和肺纤维化等）相关的肺部疾病有较好效果。在肺纤维化模型中，和常氧条件下培养的 MSCs（NP-MSCs）相比，缺氧预处理的 MSCs（HP-MSCs）在减轻博来霉素引起的气道收缩、肺水肿以及纤维化变化等方面效果更显著，并且通过使用 lacZ 报告基因的 MSC 转导评估细胞存活率发现，HP-MSC治疗组在18天后肺组织中的lacZ mRNA含量比NP-MSC组高出三倍，由此推测肺功能和组织学的改善或许与缺氧预处理提高MSC存活率相关。

通过氧化应激暴露、热休克蛋白和血清剥夺进行预处理

通过暴露于氧化应激、热休克蛋白、血清剥夺这几种方式对间充质基质细胞（MSC）进行预处理的策略，尚未在肺病模型中开展测试，但体外和体内研究结果显示这些策略具备应用潜力。

氧化应激预处理

• 作用及效果：氧化预处理不仅能促进细胞保护作用，还可提高MSC效力。先前让MSC暴露于非致死浓度的过氧化氢（20和50μM）时，其对致死剂量该化合物的抵抗力更强，对照组（0μM）约60%的MSC处于细胞凋亡状态，而20和50μM组分别约30%和40%处于凋亡状态。
• 分子机制：其细胞保护涉及的分子机制是MSC线粒体瞬时释放活性氧（ROS），进而激活细胞外信号调节激酶（ERK）通路，该通路能促进如Bcl-2和Bcl-XL等抗凋亡蛋白的表达，此策略或许有助于治疗以肺部微环境中ROS释放为特征的炎症疾病（如急性呼吸窘迫综合征、矽肺病等）。

热休克预处理

• 效果表现：热休克预处理是增加MSC存活率的一种有效方法。将MSC暴露于42°C下60分钟，可使热休克蛋白-27（HSP-27）和热休克蛋白-90（HSP-90）表达分别增加4.8倍和17.4倍。
• 作用机制及局限：这些热休克蛋白通过激活磷酸肌醇3-激酶（PI3K/AKT）、细胞外信号调节激酶（ERK）和核因子κB（NF-κB）等信号通路促进MSC存活，但尽管热休克预处理的MSC有潜在应用价值，却从未在体内进行过测试。

血清剥夺（SD）预处理

• 目的及效果：血清耗竭预处理旨在让MSC处于静止状态以减少能量需求，利于其在缺血环境中存活。在相关报告中，让MSC在无胎牛血清情况下培养48小时后植入动物体内，在缺血条件下维持3和7天，通过流式细胞术检测发现，与对照组相比，SD预处理组在第3天和第7天的MSC活力分别增加了四倍和三倍。
• 机制阐释：在SD预处理期间，生长因子缺失会抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路（更具体说是mTOR复合物1，即mTORC1），mTORC1会抑制自噬等分解代谢过程，而经过48小时SD预处理后，MSC内源性自噬体标志物LC3B-II蛋白水平高于对照细胞，且当自噬受到抑制时，半数MSC在缺血条件下培养7天后死亡，所以经此预处理的MSC存活率提高可能得益于保护性自噬过程。

运用基因操作提升间充质干细胞存活率的情况

多种遗传方法被用于提高间充质基质细胞（MSC）的存活率，虽然多数此类方法旨在增强MSC对缺血环境的抵抗力以改善心肌梗死治疗，但肝细胞生长因子过表达的MSC（HGF-MSC）也在急性肺损伤模型中进行了测试。肝细胞生长因子（HGF）本身是一种具备抗炎、抗凋亡以及修复特性的生长因子。

HGF-MSC在细胞凋亡及效力方面的表现

• 细胞凋亡情况：在体外将细胞暴露于过氧化氢（120μM）4小时后，HGF-MSC的凋亡率低于未修饰的细胞（HGF-MSC的Annexin-V阳性细胞占比为25.3%，而未修饰细胞为64.6%），且在体内，HGF过表达后，凋亡细胞数量近乎减少了一半，不过HGF提升MSC存活率的具体机制还有待进一步阐明。
• 细胞效力提升表现：HGF的上调还提高了MSC的效力。与野生型MSC相比，HGF-MSC使肺组织中的HGF水平得以提高，并且改善了氧合情况（动脉血氧分压，PaO₂水平方面，HGF-MSC为104.62±10.5 mmHg，野生型MSC为90.30±8.8mmHg），降低了肺损伤评分（HGF-MSC为0.3，野生型MSC为0.55），减少了中性粒细胞浸润（髓过氧化物酶活性方面，HGF-MSC约为600 mU/g，野生型MSC约为700 mU/g），提高了超氧化物歧化酶（SOD）水平，还上调了白细胞介素-10（IL-10，HGF-MSC约增加4倍，野生型MSC约增加2倍）。

关于凋亡间充质干细胞的相关情况

已测试了多种策略来提高MSC在体内的存活率，不过值得注意的是，有报告显示即便处于凋亡状态的MSC也具备免疫调节活性。比如在哮喘模型中，注射10⁶个凋亡的MSC相较于存活的MSC以及未进行治疗的情况，发挥了免疫抑制作用，使支气管肺泡灌洗液（BAL）中的嗜酸性粒细胞浸润显著减少一半；在脓毒症模型中，用凋亡的MSC进行治疗可改善动脉血氧饱和度，并减少肺损伤（体现为肺重与体重比方面，凋亡MSC治疗时约为0.45 × 10⁻²，对比情况约为0.4×10⁻²），但凋亡的MSC改善治疗结果的作用机制目前仍不清楚。

提高间充质干细胞效力的策略

MSC“效力”被定义为其生物活性的量度；它也是治疗效果与达到治疗效果所需的MSC剂量之间的关系。MSC效力低可能是MSC在体外扩增过程中表型发生变化的结果。此外，MSC不会自发产生免疫抑制；需要事先激活才能提高其效力。因此，了解导致MSC激活的机制非常重要。

炎症环境中影响MSC的相关因素

在存在炎症的微环境里，巨噬细胞和中性粒细胞会释放诸如干扰素（IFN）-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1、趋化因子、白三烯以及自由基等促炎介质，间充质基质细胞（MSC）能够“感知”这些介质，进而激活核因子κB（NF-κB），促使免疫调节和修复因子的表达增多。

此外，还有其他因素可激活MSC，例如微生物相关分子模式能通过Toll样受体（TLR），像TLR3和TLR4来激活MSC。其中，通过脂多糖（LPS）激活TLR4会诱导产生促炎性MSC表型，使其分泌IL-6、IL-8和转化生长因子（TGF）-β；而通过聚肌苷酸：聚胞苷酸（poly I:C）激活TLR3则会诱导出抗炎性MSC表型，使其表达吲哚胺2,3-双加氧酶、前列腺素（PG）E2、IL-4和白细胞介素1受体拮抗剂（IL-1RA）。

基于炎症环境的提高MSC效力的策略

提高MSC效力的首个策略是在炎症环境中对其进行预处理。就肺部疾病而言，中度至重度急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者的混合血清被当作激活MSC的炎症背景来使用。这种血清含有高水平的IL-10、IL-8和IL-6，以及低水平的IL-1β、TNF-α和IFN-γ。当使用0.5%的ARDS血清对MSC预处理16小时后，与对照MSC相比，MSC的IL-10（约为5倍）和白细胞介素1受体拮抗剂（IL-1RN，约为2.5倍）的表达显著增加，并且ARDS血清还能降低促炎介质的表达（详见表1）。

使用其他物质进行预处理

人们对探索提高 MSC 效力的替代方法很感兴趣，最近的研究已经探讨了MSC与其他物质的结合。这些物质包括吡格列酮、N -乙酰半胱氨酸和粉防己碱（表1）。

基因操作增强MSC

多种促有丝分裂、抗凋亡以及抗炎因子已被高效转导至间充质基质细胞（MSCs）中，这些经过基因操控的细胞在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、肺动脉高压（PAH）以及慢性阻塞性肺病的实验模型中接受了测试。

针对ARDS进行基因转导的情况 ARDS是此类技术常见的治疗目标，为有效逆转炎症过程，MSCs被转导了以下几种基因：

• 发育内皮基因座1（Del-1）：它是内皮细胞分泌的一种糖蛋白，在细胞迁移和浸润方面起着关键作用。
• ST2受体基因（sST2）：作为白细胞介素-33（IL-33）的捕获受体，IL-33-ST2轴在肺部炎症期间连接着先天性和适应性免疫反应。
• 血管紧张素转换酶2（ACE-2）：该酶能够降低血管紧张素-2（Ang-2）水平，而Ang-2是ARDS发病机制中的重要介质。
• 锰超氧化物歧化酶（MnSOD）：其可保护线粒体免受活性氧（ROS）的侵害。

转导基因的MSCs在小鼠ARDS模型中的效果

在小鼠ARDS模型中测试时，转导了上述基因的MSCs展现出诸多积极效果，具体表现为：

• 显著降低：肺损伤指数、中性粒细胞计数、促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-β和/或白细胞介素-6）水平以及支气管肺泡灌洗液（BALF）中的蛋白质含量。
• 部分提升与改善：提高了抗炎细胞因子白细胞介素-10的水平，减少了肺水肿以及肺组织中的细胞凋亡率，还提高了小鼠的生存率（相关效果总结于表2中）。

重要的是，转基因基质细胞在临床环境中的应用即将成为现实。转基因细胞已获批准，目前正在用于肺动脉高压患者的早期临床研究，如肺动脉高压和血管生成细胞治疗 (PHACeT) 试验。

结论

间充质干细胞在再生医学领域具有潜力。然而，MSC在呼吸系统疾病方面的临床试验的主要结果远远低于这些细胞在临床前研究中的理论潜力。将MSC移植转变为一种有效的程序是一项巨大的挑战。研究人员一直在寻找替代且有效的策略来提高植入MSC的存活率和免疫调节能力，从而增强组织修复。然而，尽管如本综述所述，有大量的实验证据表明存在一系列改善MSC功能的策略，但这些技术要从实验室应用到临床应用还有很长的路要走。

参考资料：Silva, L.H.A., Antunes, M.A., Dos Santos, C.C. et al. Strategies to improve the therapeutic effects of mesenchymal stromal cells in respiratory diseases. Stem Cell Res Ther 9, 45 (2018). https://doi.org/10.1186/s13287-018-0802-8

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