同济医院：神经干细胞成为神经退行性疾病和中风的新疗法

前言：由于成年哺乳动物大脑的自我修复和再生能力有限，以不可逆的细胞损伤为特征的神经系统疾病，特别是神经退行性疾病和中风，通常被认为是难治性疾病。

神经干细胞（NSC）因其自我更新和形成不同神经谱系细胞（如神经元和神经胶质细胞）的能力，在神经系统疾病的治疗中发挥着独特的作用。随着对神经发育认识的不断深入和干细胞技术的进步，可以从不同来源获得神经干细胞，并定向分化为特定的神经谱系细胞表型，使得替代某些神经系统疾病中丢失的特定细胞成为可能，这提供了新的途径。

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同济医院：神经干细胞成为神经退行性疾病和中风的新疗法

近日，华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科联合武汉大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室对神经干细胞移植治疗神经退行性疾病和缺血性中风进行了新研究。

研究结果发表在《自然》子刊“cell death discovery”上，文章证实了

• 不同来源的神经干细胞可以在体外被诱导分化为成熟且有功能的神经元或神经胶质细胞。
• 移植预分化神经干细胞可以分化成熟为特定类型的细胞，促进神经退行性疾病或中风模型的恢复。
• 目前，来自人类胚胎干细胞的多巴胺能神经元经过神经干细胞阶段，正在帕金森病患者的临床试验中进行测试。

在本综述中，我们总结了体外诱导不同来源的神经干细胞分化的策略。然后，我们概述了移植的预处理 神经干细胞在帕金森病和缺血性中风模型中的功能改善和潜在机制。此外，我们还讨论了定向诱导神经干细胞在神经系统疾病和缺血性中风的临床转化中的局限性。

开放式问题

• 对于神经退行性疾病或中风，哪种神经干细胞来源和哪种定向分化方法将使移植细胞符合良好生产规范指南？

• 移植神经干细胞分化的最佳时间窗是多少？
• 移植的预分化神经干细胞的细胞替代的潜在机制是什么？

什么是神经退行性疾病？

神经退行性疾病（ND）是一组以神经元结构或功能逐渐丧失为特征的疾病，包括帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩性侧索硬化症（ALS）和亨廷顿病（HD）等。这些疾病不仅对患者的生命构成威胁，还给家庭和社会带来沉重的经济负担。目前，针对ND的治疗主要集中在缓解症状和延缓病程，但无法实现治愈。

神经干细胞移植通过神经修复与再生治疗成为神经系统疾病的理想方法

神经修复再生疗法是治疗神经系统疾病的理想方法，其中神经干细胞（NSCS）移植策略在ND治疗中引起了越来越多的关注。

神经干细胞是一类多能细胞，具有强大的自我更新能力和分化为各种中枢神经系统（CNS）神经元和神经胶质细胞类型的能力。神经干细胞移植在多种病理条件下已被证实，例如癫痫、MS、缺血性中风和AD。基于NSC的疗法已在许多ND和缺血性中风的啮齿动物模型中得到实施，一些研究提出了NSC改善疾病的潜在机制，包括神经炎症抑制、神经元替代、免疫调节和神经营养支持，从而促进ND和中风模型的恢复。

神经干细胞移植策略作为再生医学的一种，在NDs的治疗中受到越来越多的关注。此外，随着干细胞领域的进步，用于移植的NSCs来源已从最初的直接分离脑组织扩展到多能干细胞（PSCs）的分化和体细胞的转分化。迄今为止，基于NSC的疗法已在许多ND和缺血性中风的啮齿动物模型中实施，并且一些研究提出了解释NSC改善疾病作用的潜在机制，包括神经炎症抑制、神经元替代、免疫调节和神经营养支持，从而促进ND和中风模型的恢复。

然而，直接移植NSC面临低存活率和不合理分化的挑战。在ND和缺血性中风中，中枢神经系统先天免疫细胞的慢性或急性激活可以观察到，神经炎症反应诱导的宿主微环境可能在移植NSC的存活和分化中起着关键作用。此外，参与炎症途径的自噬已被证明可以调节移植NSC的分化。因此，炎症反应可能会对移植NSC参与功能恢复的能力产生不利影响。

为了克服直接移植NSC的局限性，并考虑到某些ND具有特定细胞类型丢失的病理特点，人们致力于探索移植前操控NSC命运以控制终末谱系从而替代ND丢失细胞的可行性。通过化学定义系统或异位过表达关键的谱系特异性转录因子，不同来源的NSC可以在体外定向分化为特定类型的神经谱系细胞，如DA能神经元、GABA能神经元、胆碱能运动神经元、少突胶质细胞、谷氨酸能神经元等。随后的研究已经进行了预分化细胞的体内移植，以探讨其在神经系统疾病中的治疗作用（图1）。

不同来源神经干细胞体外定向分化

神经干细胞（NSC）的获取可以通过三种不同的方式实现：从原代中枢神经系统（CNS）组织直接提取、从多能干细胞（PSC）分化以及从体细胞转分化（图2）。以下是这三种方法的详细说明：

从原代CNS组织直接提取NSC：

• NSC在发育中的大脑中广泛存在，而在成年哺乳动物的大脑中，它们主要位于海马的颗粒下区、脑室下区以及整个脑室系统的多个部位。从这些区域可以分离出NSC，这些细胞具有自我更新和多向分化潜能。

PSC分化为NSC：

• PSC，包括胚胎干细胞（ESC）和诱导性多能干细胞（iPSC），可以通过体外诱导分化为NSC。主要有两种方法：胚状体（EB）形成和贴壁单层培养。
• 神经分化过程是多步骤的，首先通过去除促进自我更新的介质来触发向所有三个胚层分化，随后抑制胚外和中胚层内胚层分化，并在无血清培养基中培养细胞以利于神经分化。
• 双重SMAD抑制（同时抑制转化生长因子β和BMP信号通路）可降低培养变异性并提高神经诱导效率。
• PSC的神经诱导也可以通过与基质细胞饲养层共培养来实现，这可以为限制PSC向神经谱系的命运提供线索。

从体细胞转分化为NSC：

• 诱导性NSC可以直接从体细胞（如外周血单核细胞（PBMNC）、成纤维细胞和其他细胞类型）重编程。
• 这种转分化技术允许从患者自身的体细胞中生成NSC，这对于个性化医疗和避免免疫排斥反应具有重要意义。

不同来源的NSC可以被诱导分化为所需的神经谱系细胞，这为研究和治疗神经系统疾病提供了多种可能性。每种方法都有其独特的优势和挑战，选择合适的方法取决于具体的应用需求和研究目标。

目前，NSCs可通过三种途径获得：1）从原代中枢神经系统组织中分离，主要包括成人和胎儿的脑组织；2）通过EB形成或单层培养从多能干细胞（iPSC和ESC）分化，双重SMAD抑制可以促进神经诱导过程；3）由体细胞转分化，如血细胞和成纤维细胞。CNS中枢神经系统、EB胚状体、ESC胚胎干细胞、IPSC诱导多能干细胞。

了解神经系统的自然发育对于操控神经干细胞（NSC）的定向分化至关重要。在胚胎发育过程中，神经管沿背腹轴和前后轴经历精确的模式化过程，这一过程由组织者（即释放模式化分子来调节NSC命运的小细胞群）调控。以下是一些关键点，概述了这一过程和相关的模式化分子：

模式化分子的作用：

• 成纤维细胞生长因子（FGF）、无翅型MMTV整合位点家族（WNT）和视黄酸（RA）参与前后模式化。
• WNT、骨形态发生蛋白（BMP）和音猬因子（SHH）影响背腹模式。

形态发生素梯度：

• 形态发生素的梯度可以调节定义转录代码的内在信号通路。

体外诱导NSC分化的方法：

• 化学定义系统：通过模仿体内神经发育的区域模式原理，在体外诱导不同来源的NSC分化。
• 内在转录因子介导的方法：通过该方法可以产生所需的神经谱系细胞类型，例如多巴胺能（DA）神经元、中脑棘状γ-氨基丁酸介导（MSN）神经元、胆碱能运动神经元、少突胶质细胞和皮质谷氨酸能神经元。

神经诱导过程：

• PSCs（包括ESCs和iPSCs）的神经分化过程是多步骤的，首先通过去除促进自我更新的介质来触发向所有三个胚层分化，随后抑制胚外和中胚层内胚层分化，并在无血清培养基中培养细胞以利于神经分化。
• 双重SMAD抑制（同时抑制转化生长因子β和BMP信号通路）可降低培养变异性并提高神经诱导效率。

神经诱导的相似性：

• 这两种人类PSC的神经诱导方法与体内神经诱导过程非常相似，从而产生具有背前脑身份的NSC。

共培养方法：

• PSC的神经诱导也可以通过与基质细胞饲养层共培养来实现，这可以为限制PSC向神经谱系的命运提供线索。

到目前为止，已开发出两种主要的诱导分化方法：化学定义系统和内在转录因子介导的方法，通过该方法可以产生所需的神经谱系细胞类型，例如 DA 能神经元、MSN、胆碱能运动神经元、少突胶质细胞和皮质谷氨酸能神经元（图3)。

神经干细胞诱导定向分化在神经系统疾病模型中的治疗潜力

目前涉及的主要神经疾病模型包括PD、HD、MS、ALS和缺血性中风。在这里，我们主要概述了NSCs衍生的特定表型在慢性神经退行性疾病PD和急性神经退行性缺血性中风中的治疗潜力。

帕金森病

帕金森病（PD）是一种进行性神经退行性疾病，病理特征是黑质紧密层的DA能神经元变性，随后支配纹状体的DA能轴突末梢丢失，导致运动障碍。

目前，PD的主要治疗方法是多巴胺替代疗法。然而，它只能缓解PD的症状而不能延缓PD的进展。关于体外靶向分化VM DAergic神经元的成功，一些研究已将这些细胞移植到不同的PD模型中，以观察它们在行为、细胞和分子水平上的治疗效果。

上述大多数研究将预分化的NSC植入6-OHDA或MPTP诱导的PD模型的纹状体中，导致感觉运动改善，例如自发活动增加和转圈行为减少。考虑到放置在黑质中的VM组织移植物无法将轴突延伸足够长以到达其目标区域纹状体以形成复杂的神经回路，因此考虑异位植入。植入后，其中一些经过预处理的NSC可以在PD动物模型中存活，并表现出黑质DAergic神经元的表型，多巴胺水平增加。

• 延申阅读：拜耳表示神经元干细胞疗法治疗帕金森病：首个1期临床试验取得积极结果

因此，目前的研究表明，异位和同位移植的VMDA神经元都可以进行突触前和突触后整合，并且很自然地假设重建的功能性黑质-纹状体回路导致PD模型中的运动恢复。

除了移植位置，DA能神经元分化的最佳移植时间窗对黑质-纹状体回路的重建也很重要。以VM组织为供体，移植时供体细胞的成熟度显著影响移植物的组成和功能结果。具体来说，在DA神经发生高峰期（胚胎第12天）之前分离的供体组织在移植物中产生更多的DA能神经元，这归因于植入时DA神经母细胞存活和增殖增加。

缺血性中风

缺血性中风是一种严重的脑血管事件，虽然它不是一种神经退行性疾病，但它会导致梗死区域的病理性细胞死亡，包括不同类型的神经元和神经胶质细胞。

目前，缺血性中风的治疗手段相对有限，主要包括血管内手术（血栓切除术）和静脉注射阿替普酶（血栓溶解）以恢复血流。然而，这些治疗方法存在一定的局限性，如治疗窗窄、存在禁忌症、疗效低以及再灌注损伤等问题，导致只有少数患者能够从中受益。

近年来，细胞替代疗法在缺血性中风治疗中显示出潜力。一些研究针对缺血性中风中丢失的不同细胞类型，通过移植特定细胞来重建受损的神经回路。

• 例如，一项临床和影像学研究显示，卒中患者症状最严重时受损细胞的分布往往不在纹状体中，这表明细胞替换策略应强调重建受损的皮质而不是纹状体。研究将来自PSCs的具有皮质谷氨酸能表型的祖细胞植入缺血性卒中大鼠模型的皮质中，发现这些细胞在移植后可以减轻感觉运动障碍。

此外，移植细胞能够从丘脑皮质接收突触输入，并能够根据生理感觉刺激调节自身活动，表明功能回路重建是移植后晚期时间点运动功能恢复的原因。

除了感觉运动功能障碍外，大多数中风幸存者还患有认知障碍，这可能与少突胶质细胞死亡导致的脑白质脱髓鞘有关。

• 徐等人提出了一种两步方案，可从iPSC中稳定、快速地获得NG2阳性OPC，将OPCs移植到缺血大鼠的脑室后发现，这些细胞可以通过抑制炎症和免疫反应来保护宿主神经元在缺血环境下免于死亡。此外，这些细胞通过促进缺血性中风大鼠的髓鞘再生过程，在一定程度上挽救了学习和记忆丧失。

综上所述，干细胞治疗缺血性中风的研究进展显示，基于干细胞的疗法可以改善缺血性中风患者的神经功能缺陷和日常生活活动能力。这些研究为缺血性中风的治疗提供了新的视角和潜在的治疗策略。随着临床试验的进行和科学研究的深入，未来可能会有更多有效的治疗方法被开发出来，以改善患者的生活质量和预后。

讨论和未来方向

根据您提供的背景信息和搜索结果，我们可以讨论以下几个关于神经退行性疾病治疗和未来方向的关键点：

靶向分化方案的优化：目前，外部培养系统正逐渐从最初的共培养或使用定义不明确的异种因子转向完全化学定义和无异种因子的条件，这有利于建立更稳健的分化方案。这意味着未来的研究将更加注重创建一个清晰和可控的环境，以促进神经干细胞（NSC）的定向分化。

形态发生素、生长因子和小分子的使用：进一步探索这些因子在浓度、顺序和持续时间方面的使用对于优化NSC的分化至关重要。这些因素对于实现分化细胞的充分成熟和长期表型的维持非常关键。

表观遗传机制的调控：越来越多的研究表明表观遗传机制可以调控神经分化中各种发育信号通路的激活和抑制之间的相互作用。例如，精细地调节遗传程序以协调不同的神经谱系分化。

RNA干扰技术的应用：随着RNA干扰技术的进展，它们也可以用于指导NSCs的靶向分化。

三维诱导和生物材料的应用：利用生物材料进行三维诱导以有效控制干细胞的命运越来越受到重视。

导电聚合物和电刺激的应用：导电聚合物已被证明可以在体外通过电刺激诱导神经干细胞定向分化。

移植细胞的病理性生长的解决策略：人们正在积极采取多种策略来解决各种来源的移植细胞可能出现的病理性生长，如利用细胞分选技术在移植前去除脱靶污染细胞类型或转导配体激活的自杀基因以在体内消融增殖细胞。

诱导神经元（iN）技术的发展：直接对体细胞进行重编程以获得功能性神经元已成为可能。然而，iN方法将体细胞直接转化为非分裂神经元，而不是命运定向的神经元祖细胞，这些非分裂神经元移植后往往难以在宿主脑中存活，整合也较差。

细胞移植策略的个性化：在进行供体细胞移植前应充分考虑不同神经系统疾病所呈现的具体病理状态，这可能在一定程度上影响细胞移植策略。

除了移植定向诱导的神经干细胞外，体内细胞重编程和神经胶质细胞原位转化为功能性新神经元：这是一种很有前途的神经再生策略。

基因工程改造的干细胞：移植的外源性干细胞可以通过基因工程稳定地产生生长因子，支持修复功能失调的内源性神经元。

临床前研究和临床试验的进展：近期的临床前研究已证明源自PSC的DAergic神经元的安全性和有效性。基于这些有希望的结果，不同国家正在进行临床试验。

这些方向展示了神经退行性疾病治疗领域的广泛研究和未来潜力，特别是在干细胞疗法和基因编辑技术方面。随着技术的不断进步和临床试验的开展，我们有望在未来看到更多有效的治疗方法被开发出来。

参考资料：Nie, L., Yao, D., Chen, S. et al. Directional induction of neural stem cells, a new therapy for neurodegenerative diseases and ischemic stroke. Cell Death Discov. 9, 215 (2023). https://doi.org/10.1038/s41420-023-01532-9

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