在生物医学飞速发展的当下,多能干细胞的研究为神经系统疾病的治疗带来了前所未有的曙光。其中,来自多能干细胞的神经细胞药物,正逐渐从实验室的理论设想迈向临床应用的现实。这一创新疗法不仅有望重塑神经系统疾病的治疗格局,更可能为无数患者带来新的希望。本文将深入探讨这类神经细胞药物从研发构思到临床前评估的每一步历程,剖析其背后复杂而精妙的科学进程。
1.有关神经系统疾病及干细胞治疗神经系统疾病的介绍
神经系统是人类各种认知和运动功能的控制中心,神经系统紊乱会导致严重的神经系统疾病。近年来,神经系统疾病已成为全球死亡和残疾的一个重要原因,例如神经退行性疾病和神经损伤,2016年分别影响了900万人和2.76亿人。由于中枢神经系统( CNS )的自我修复能力有限,针对中枢神经系统疾病的治愈方法仍然很少。
长期以来,细胞替代疗法一直是治疗神经系统疾病的一种非常有前景的方法。胎儿脑源性神经干细胞 (NSC) 和腹侧中脑 (VM) 组织分别在治疗中风和帕金森病 (PD) 方面表现出积极作用。然而,由于伦理限制和细胞质量的变化,胎儿组织的应用往往受到限制。人类多能干细胞 (hPSC),包括人类胚胎干细胞 (hESC) 和人类诱导多能干细胞 (hiPSC),由于其无限的自我更新能力和向所需外胚层细胞类型的多分化潜力,为移植提供了可行的神经元细胞来源。到目前为止,几种 hPSC 衍生的神经元细胞类型已在神经系统疾病模型中成功测试,并已证明其体内安全性和有效性。一些国家还启动了首次人体临床研究。
不过,细胞衍生物制备和质量评估挑战重重,涉及细胞类型选择、分化阶段确定、动物模型构建、质量控制等多方面,这严重阻碍了干细胞临床应用和商业化。
鉴于各国要求不同,监管政策有差异。国际干细胞银行计划汇聚研究人员,发表系列文件,就多能干细胞临床转化达成全球共识,涵盖质量控制、伦理等方面,推动了转化并保障细胞产品质量安全,还与其他组织合作推进细胞药物制造标准化。
将多能干细胞转化为神经细胞药物要经过开发、生产和临床前评估三大工序
在干细胞治疗帕金森病领域,GForce-PD发挥国际协调作用。本文总结干细胞治疗临床前研究原则,为学术产品开发者提供指导,实际应用需遵循当地法规[1]。
2.早期原则和产品开发
2.1 细胞获取的伦理原则
- hESC和hiPSC依赖人类捐献者,获取捐献者细胞需遵循国际公认原则(如ISSCR 2016指南)与当地法律法规。
- 每个细胞系必须有捐献者 / 主治医生签署的知情同意书,以及医院的伦理支持文件。
- 要告知捐献者隐私保护的限制,以满足安全性和可追溯性需求。
2.2 细胞供体的选择
- 需对胚胎或细胞捐献者进行仔细风险评估,筛查各类潜在人类传染性病原体,如 HIV、HBV、HCV 等严重血源性病毒性疾病。
- 根据捐献者选择过程中的信息,考虑筛查其他生物体。
- 专业评估还应考量遗传病。
- 建议收集捐献者血液样本的ABO血型、HLAI类和 II 类基因型信息,用于检查衍生细胞系身份,以及匹配细胞系血液和组织类型,降低患者免疫反应。
2.3 适当的神经细胞类型
- 合适的细胞分化条件决定神经元细胞多样性,不同细胞表型特性和功能各异。
- 帕金森病由黑质中脑多巴胺能神经元(mDA)丢失引发,只有mDA细胞能在帕金森病模型中建立正确连接,获得治疗效果,前脑/后脑神经元无效。
- 肌萎缩侧索硬化症(ALS)特征为上下运动神经元丢失,由反应性星形胶质细胞毒性引起,除移植运动神经元,移植健康星形胶质细胞改善微环境也是有效治疗方法。
- 脑损伤、中风和脊髓损伤等涉及多种神经细胞功能丧失和微环境变化,使用单一神经元细胞恢复连接有挑战,神经干细胞(NSC)能分化成神经元且分泌神经营养因子,是有前途的治疗细胞类型。
2.4 移植细胞的阶段
- 基于 hPSC 的神经替代疗法,移植阶段的选择很关键。
- 早期神经祖细胞存活神经元产量高,但有不受控制增殖风险;成熟神经元移植后存活率差。
- 移植细胞的存活情况和动物模型行为改善可提示适当的移植阶段。需找出不同阶段(增殖祖细胞、有丝分裂后神经母细胞、成熟神经元)的特定标志物。
- 帕金森病细胞治疗研究中,早期有丝分裂后神经元应用最广泛;星形胶质细胞移植中,谱系限制性祖细胞应用广泛,但各制造阶段最佳细胞表型仍待进一步研究。
3.细胞制造质量控制的一般考虑因素
3.1 质量管理体系
- 完善的质量管理体系(QMS)对确保细胞库运营和细胞生产的可靠输出极为关键,建议遵循适用于许可产品的良好生产规范(GMP)。
- QMS 需针对制造产品,明确制造商责任、采用标准及所有制造程序摘要,涵盖捐赠者样本收集、原材料选择等一系列操作程序与质量文件。
- QMS 要保证从原材料到最终产品的所有材料和程序具有可追溯性,通常在质量手册中阐述一般程序、相关标准和政策。
3.2 细胞株存库流程
- 制备临床细胞产品的首要步骤是确保建立 hPSC 的供体适用性,保存生产细胞的早期库存,选择符合 GMP 标准的科学质量控制和安全测试线。
- 依据适用标准选择和鉴定试剂及材料,如 “无异种” 和化学成分明确的培养基等。
- 为减少不同批次细胞差异,建议采用包含主细胞库(MCB)和工作细胞库(WCB)的多级细胞库系统作为生产培养物供应起点。
3.3 hPSC 的质量控制
- hPSC 作为起始材料,其质量对确保最终产品的质量和可重复性意义重大。
- 需对细胞库材料进行适当的质量控制检测,包括细胞形态、活力、DNA 指纹等多项测试。
- hPSC 的批次间差异可能是工艺差异的主要来源,因此需开发大量同一批次的 hPSC 。
3.4 产品过程管理
- 整个生产过程中,必须严格把控细胞产品质量。质量管理体系应在关键步骤指明特定的质量控制测试,如细胞标志物和微生物测试,以保证提供具有特定传代水平的可重复细胞制剂。
- hPSC 衍生产品的生产过程主要包括 hPSC 生产和神经元细胞生产两部分。hPSC 生产中,扩增时要进行过程测试以确保其保持内在特性;神经元细胞生产中,在分化过程的不同时间点进行多项质量控制测试,文中图1总结了当前通用的已发布工作流程。
3.5 移植细胞的纯度
- hPSC 神经替代疗法的关键挑战是获取高同质性目标细胞类型。需明确最终细胞产品全部组成并清除残留干细胞,因其有安全风险。
- 临床证据显示,污染的5-羟色胺神经元可致PD患者移植物诱导的运动障碍,临床前研究表明残留祖细胞会在脑或脊髓中异常增殖或形成结构。
- 部分研究团队采用特定表面标志分选细胞、添加槲皮素等策略提高纯度,且需验证无未分化细胞。
3.6 细胞配制和保存
- 细胞作为“活药物”,其生物过程持续进行且受环境影响,建立有效保存制度很关键。
- 细胞制剂分新鲜非冷冻和冷冻保存两类。新鲜细胞活力和特性好但寿命短,不适合长期储存和全面质控;冷冻细胞保质期长,可进行质控和安全放行测试,但冻融有损伤等问题。
- 应选择适合神经元细胞的冷冻保存液,并验证冷却、解冻条件,且解冻后24小时细胞活力和恢复情况可准确反映冷冻效果,同时要按 ICH Q5C 指南研究细胞产品储存和运输稳定性。
3.7 细胞产品放行测试
- 细胞产品关键质量属性是体内安全有效的前提,需对产品批次按预定比例测试。
- 评估系统包括生物污染、细胞活力等体外测试,应基于多批次数据制定放行测试公差。
- 基因组完整性检测(如全基因组测序)有助于了解遗传变异风险,但要明确基因变化与患者安全相关性,虽无统一基因组稳定性标准,可参考已发表研究,选择无癌症相关基因大异常或非同义突变细胞有助于降低致瘤风险,但不能完全认证体内安全性。
4. 临床前体内评估
4.1 细胞移植的部位
- 神经元细胞移植旨在组织替代或提供局部营养,需将细胞递送至目标部位。例如中风时在缺血半暗带移植以拯救细胞和重建神经网络;ALS 最佳途径是鞘内注射;PD 治疗可将细胞移植到背侧纹状体或黑质。
- 啮齿动物一到两个部位移植可实现神经支配,灵长类动物大脑较大,为实现足够神经支配,PD 临床研究中每个半球常需三到八个注射道,非人灵长类动物在移植策略评估上因大脑与人类相似具有优势,小动物移植策略不足以模拟人类治疗。
4.2 毒性试验及剂量耐受性
- 界定细胞毒性和剂量耐受性对新药至关重要。毒性测试应遵循临床途径,研究对靶器官及肝脏、心脏、肾脏等非靶器官的毒性作用。
- 高剂量细胞给药安全风险更大,动物实验中设置不同剂量组确定最大可行剂量可为临床研究提供支持,当细胞在体内可能增殖时,剂量确定更具挑战性,大鼠或小鼠脑内和脊髓接受细胞数量有一定范围。
4.3 过度生长和致瘤性检测
- hPSC 衍生细胞安全性需考虑不受控制的增殖和肿瘤形成。过度细胞生长会影响宿主细胞网络和功能,要通过对足够数量动物进行组织病理学和免疫组织化学分析研究移植物体积和增殖标志物,移植物体积与移植细胞性质有关,如较年轻或分化程度低的细胞扩增更广泛,纯化神经元制剂细胞损失和移植物尺寸减小。
- 要区分致癌性(宿主正常细胞受刺激形成肿瘤)和致瘤性(与移植细胞有关),为确定未分化 hPSC 污染情况,一些研究小组进行加标研究。
4.4 体内存活和分布
- 神经细胞移植期望在宿主体内长期存活以替代丢失细胞,但因细胞消化、机械损伤和微环境改变等,大量移植细胞会死亡,移植 DA 存活率低,移植后第一周对细胞存活很关键,抑制 p53、改变聚唾液酸表达或注射 GDNF 有助于提高细胞存活率。
- 虽神经元细胞长距离迁移证据少,但需证明注射后细胞分布,非侵入性细胞追踪方法可用于监测动物,避免多个时间点处死动物。
4.5 体内细胞命运
- 移植的神经元细胞多由 NSC 和未成熟祖细胞组成,需在体内进一步分化成熟。体外分化技术可靠,但体内复杂微环境会影响细胞命运造成异质性,单细胞 RNA 测序显示移植的多巴胺能祖细胞可产生多种细胞类型,不同 NSC 系在脊髓产生神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞的比例不同,因此确认细胞产物在体内转化为所需细胞类型及是否存在危险细胞类型很重要。
4.6 细胞功效评估
- 动物模型疗效评估是临床试验的先决条件,理想动物模型应再现患者病理病变和行为症状。小鼠和大鼠模型因易获取和成本低常用于疗效测试,非人灵长类动物模型在神经系统疾病研究中更具优势,更能准确预测人类细胞剂量效应和疗效。
- 应开发和使用有效的行为评估方法和标准证明细胞产品功效,功能终点包括细胞支配、神经回路重建等方面研究,有助于理解作用机制,鼓励研究人员发表临床前结果以进行严格验证,多项使用 hPSC 衍生神经元细胞的临床研究正在进行。
5. 挑战与未来前景
5.1 即用型冷冻保存格式
- 细胞冷冻保存的发展为细胞替代疗法创造了条件,但有效细胞产品面临配方开发难题。当前多数冷冻产品输注前需解冻后清洗、浓缩以去除 DMSO 等赋形剂,这一额外处理增加安全风险,还可能损害细胞稳定性。
- 未来配方开发的主要方向是研发含更少赋形剂、更简单(甚至不含 DMSO)的冷冻保存溶液,实现无需额外操作或仅简单稀释的即用型神经元细胞产品。甘油等其他冷冻保护剂可作为替代选择,且地松鼠 iPSC 衍生神经元独特的抗寒途径,为促进神经元细胞临床应用带来潜力。
5.2 功能检测的替代标记
- 预测神经成熟和体内结果是细胞置换面临的挑战。移植神经元细胞成熟与整合耗时数月,功能评估需大量时间和动物。
- 鉴定替代标志物能显著提升细胞质量和研究效率,为产品效力测定及放行测试提供基础。Parmar 团队通过 RNA-Seq 明确多巴胺能祖细胞基因表达与体内结果的关系,确定了相关标志物,推动了该领域进展。后续有望发现更多此类生物标志物,但需投入验证工作。
5.3 低免疫原性细胞产品
- 免疫排斥是细胞替代疗法的关键问题,多数试验采用同种异体细胞产品,而神经元细胞替代疗法需植入细胞长期存活。尽管中枢神经系统有免疫特权,但同种异体细胞在大脑中的免疫排斥仍存在。
- 传统克服方法是使用免疫抑制药物,但其有副作用,会增加感染和肿瘤形成风险,对老年患者(退行性疾病治疗的关键人群)威胁更大。
- 生成通用相容细胞是可行途径。一是通过基因编辑使 hPSC 的 HLA 沉默,该策略已在体外和体内证实可靠,但此类工程通用神经元细胞的应用尚未见报道;二是收集含多种 HLA 类型或单倍型的 hPSC 系,已在非人类灵长类动物中验证并在临床研究中尝试。不过这两种方法各有利弊,临床应用前需获取细胞安全性和低免疫原性的有力证据。
总结来说,hPSC衍生神经细胞临床研究虽进展迅速,但面临诸多挑战,需深入研究以提升神经细胞产品的安全性与有效性,尤其是关注潜在致瘤性和功能效力测定方面 。
参考资料:Sun Y, Feng L, Liang L, Stacey GN, Wang C, Wang Y, Hu B. Neuronal cell-based medicines from pluripotent stem cells: Development, production, and preclinical assessment. Stem Cells Transl Med. 2021 Nov;10 Suppl 2(Suppl 2):S31-S40. doi: 10.1002/sctm.20-0522. PMID: 34724724; PMCID: PMC8560198.
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