间充质干细胞/基质细胞 (MSC) 因其多能性、免疫调节特性和促进组织修复的能力，已成为再生医学领域极具前景的治疗药物。近期研究表明，MSC 的治疗作用主要由其旁分泌释放细胞外囊泡 (EV) 介导，其中包括外泌体，这是一种促进细胞间通讯的膜结合小颗粒。MSC衍生的EV (MSC-EV) 富含蛋白质、RNA和脂质，可以调节受损组织的微环境，增强细胞迁移、增殖和分化等再生过程。本章重点介绍MSC-EV及其治疗潜力。

解码间充质干细胞外囊泡：从生物发生机制到临床转化全景

文中涵盖了各种EV分离方法，并探讨了EV的储存、表征和临床应用，表明它们提供了一种比传统细胞疗法更安全、更具可扩展性的替代方案。然而，将MSC-EV的生产、分离和表征标准化以供临床使用仍然具有挑战性。未来的研究应侧重于优化流程、了解MSC-EVs药代动力学以及针对最大治疗潜力的机制^[1]。

1、简介

间充质干细胞治疗潜力与机制认知演变

间充质干细胞（MSCs）因其多向分化潜能（可分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞）及自我更新能力，成为再生医学领域的明星疗法。传统理论认为，移植的MSCs能归巢至损伤部位，通过直接分化为目标细胞（如软骨细胞）修复组织。但最新研究表明，MSCs主要通过旁分泌途径释放生长因子、趋化因子和细胞因子发挥治疗作用，而非直接分化。尽管其修复机制尚未完全阐明，MSCs仍被广泛用于免疫调节和组织再生临床试验。

间充质干细胞在临床应用面临的多重挑战

MSC疗法存在显著局限性：供体差异（健康状态、遗传背景、年龄性别）导致细胞异质性；组织来源（骨髓、脂肪、脐带等）影响干性及分化能力；培养条件（融合度、氧气浓度、传代次数）改变扩增效率；免疫相容性受宿主微环境（如炎症状态）调控，可能触发MHC-II类分子表达。此外，给药方式、移植位点及载体材料也制约细胞归巢效能。

外泌体疗法的突破性进展

新证据揭示MSCs通过分泌营养因子协调再生过程（细胞迁移、增殖、基质合成等）。2010年研究发现，MSCs衍生的外泌体（MSC-Exos）可缓解心肌缺血再灌注损伤，此后其在软骨修复中展现潜力。目前临床试验主要采用脂肪、骨髓或脐带来源的MSC-Exos，其中脂肪组织为临床研究首选来源，且因外泌体低免疫原性，异体移植成为主流方案。但MSC-Exos尚无标准化制备流程。

细胞外囊泡的研究进展

细胞外囊泡（EVs）是脂质双分子层包裹的纳米颗粒，携带跨膜蛋白、RNA及代谢物，介导细胞间通讯。自1946年首次在血液中被发现，EVs历经数十年研究：1960年代称”血小板尘埃”；1980年代在直肠腺瘤细胞中被观测；1987年”外泌体”术语正式确立。77年来，学界确认几乎所有细胞均分泌EVs，其广泛存在于生物体液中，成为疾病诊疗的新靶点（表1）。

2、细胞外囊泡的分类

EVs的核心功能与生物意义

细胞外囊泡（EVs）是细胞间通讯的关键信使，负责传递包括蛋白质、核酸、代谢物甚至完整细胞器在内的多种“货物”。它们在多种生物体的生理和病理条件下促进细胞间通讯的作用已被广泛研究。所有细胞类型（包括干细胞）均可分泌EVs，并存在于唾液、泪液、血浆、血清、脑脊液、支气管液、滑膜液、羊水、母乳、尿液、精液、淋巴液、胆汁和胃酸等体液中。

值得注意的是，EVs的分泌和成分可适应不同生物环境，因此成为多种疾病的重要生物标志物。此外，科学家已将EVs开发为药物递送载体，并将其作为独立治疗剂使用。

分类体系的演变与争议

EVs是由各类细胞释放到胞外空间的膜性纳米颗粒，在细胞间通讯中发挥关键作用。它们携带独特的“货物”（包括核酸、蛋白质和信号分子），反映源细胞的状态。国际细胞外囊泡学会（ISEV）2018年指南提出了分类系统，但传统的三分类法仍普遍使用：根据尺寸、生物形成机制和表面标志物，EVs可分为外泌体、微囊泡（MVs）和凋亡小体（表2）。

• 外泌体（直径30–150nm）：通过多囊泡体（MVBs）与质膜融合形成；
• 微囊泡（直径50–1000 nm）：由质膜向外出芽并脱落产生；
• 凋亡小体（直径50–5000 nm）：细胞凋亡过程中产生。

由于三分类法中存在表面标志物不明确和尺寸重叠的问题，ISEV建议采用修订方案：按物理特性（如<200 nm为小型EVs，>200 nm为大型EVs）、密度（低/中/高）、表面标志物（如CD63+或膜联蛋白V染色的EVs）、细胞来源（如MSC衍生的EVs）或细胞状态（如缺氧EVs）分类。

新型非囊泡颗粒的突破性发现

随着分离技术进步，EV领域扩展到非囊泡细胞外颗粒（NVEPs）——这类无脂质双层的颗粒包括脂蛋白、穹窿体，以及新发现的外泌聚合体（exomeres，~35nm）和超级聚合体（supermeres）。外泌聚合体含糖酵解酶等特定蛋白，可通过不对称流场流分离技术（AF4）获取；超级聚合体则在外泌聚合体上清液中发现，具有独特蛋白/RNA组成，能穿越血脑屏障，在结直肠癌细胞中携带大量胞外RNA，并可介导代谢重编程与耐药性传递，为疾病机制研究开辟新方向。

3、EV的生物合成和吸收

EVs的摄取机制

靶细胞通过受体介导内吞、网格蛋白包被小窝、脂筏、吞噬作用、小窝蛋白介导内吞及巨胞饮等多种途径摄取完整EVs。囊泡进入靶细胞后可逃逸内体/溶酶体以释放内容物。EVs与靶细胞膜相互作用可诱导两种结果：一是通过配体-受体相互作用触发细胞内信号传导，二是外泌体直接与细胞膜融合，将内容物释放至胞质。值得注意的是，EVs的靶细胞涵盖癌细胞、损伤实质细胞及免疫细胞，凸显其在细胞通讯与生理过程中的广泛影响[23,33]。

外泌体的生物发生核心

外泌体在内体系统中形成：晚期内体膜向内出芽，在多泡内体（MVEs）内形成腔内囊泡（ILVs）。此过程重定位跨膜蛋白（胞外域朝外、胞质尾朝内）并封装货物。MVEs与细胞膜融合后，释放30–150 nm的外泌体[27,33,35]。ESCRT复合物（运输所需内体分选复合体）在ILVs分选及外泌体形成中起关键作用，同时参与细胞膜向外出芽释放囊泡和病毒的过程[36]。

关键调控蛋白的作用

Syntenin 1与四跨膜蛋白（TSPANs，如CD9/CD63/CD81）共同调控外泌体形成与货物装载[27,37-39]。Syntenin 1虽主要富集于小型EVs，但也存在于大型EVs中；TSPANs虽是经典外泌体标志物，但最新研究发现含TSPAN的小型EVs可直接源自细胞膜（称为胞外体或微囊泡）。其中CD63通过介导质膜与细胞器间的循环通路定向引导EV货物分选。

RAB蛋白的精密调控

小G蛋白RAB家族（如RAB7/11/35/27A/27B）协调囊泡运输与外泌体释放：

• RAB7调控内质网（ER）-内体接触位点，促进外泌体生成；
• RAB27A介导ARL8B向RAB27A的转化，驱动ILVs向细胞膜运输；
• RAB13负责释放含β1-整合素的小EVs（区别于CD63+外泌体）；
• RAB31参与ESCRT非依赖的外泌体形成通路。抑制这些RAB蛋白将阻断外泌体分泌。

生物发生的双路径机制

ESCRT依赖途径	ESCRT非依赖途径
晚期内体膜向内出芽形成ILVs	神经酰胺-鞘磷脂转换介导ILVs生成
MVB成熟后与质膜融合释放外泌体	微囊泡（MVs）通过质膜向外出芽形成
主导跨膜蛋白分选	涉及细胞骨架降解等机制

EVs释放后的三大归宿

• 邻近细胞捕获：影响局部细胞通讯与微环境；
• 亲代细胞重吸收：形成复杂反馈调节环路；
• 进入循环系统：被远端器官细胞摄取，实现长程跨组织通讯。
  此过程凸显EVs作为系统性信号载体的核心功能。

4、EV的生物学功能

EVs的生理与病理全景作用

近期有力证据表明，胞外囊泡在正常生理过程和疾病等各个领域发挥着重要作用。正常生理过程包括发育、组织稳态、衰老、代谢调节、运动、应激反应、昼夜节律、妊娠期分子转移、母乳喂养、进食和寄生虫相互作用。疾病可分为非感染性疾病和感染性疾病，包括癌症、炎症、代谢紊乱、自身免疫、神经退行性疾病、慢性肺阻塞性疾病和成瘾，以及由病毒、原生动物、真菌、蠕虫、节肢动物和其他病原体引起的各种传染病。

核心生物学机制解析

EV在细胞自主和互动功能中都发挥着关键作用，包括供体细胞中的蛋白质质量控​​制、介导信号传导、分子转移和 ECM 重塑。蛋白质质量控​​制的关键机制是外泌体生物合成，它能够快速、选择性地从质膜上消除蛋白质。

其中，EVs的核心功能包括：

蛋白质质控：通过外泌体生物发生清除质膜异常蛋白；

废物清除：分泌未屏蔽RNA、化学修饰RNA及淀粉样蛋白（amyloidogenic proteins）；

多信号传递：作为”复合信号粒子”转移功能性受体/效应器；

ECM调控：参与骨形成、血栓启动及神经退行病变中淀粉样聚集体扩散。

5、间充质干细胞疗法的瓶颈与认知革新

MSC 具有一系列有益特性，包括免疫调节、促血管生成、促神经生成、抗凋亡和抗炎能力，这些特性归因于其固有的归巢至损伤部位的能力。

最初，人们认为MSC通过归巢至受损组织并植入，然后分化取代受损细胞来介导愈合。然而，后续研究表明，MSC 的旁分泌作用才是其治疗益处的主要原因。然而，MSC的典型细胞活动（包括自我复制和分化）会带来风险，包括致癌转化和免疫介导的排斥反应。因此，由于相关风险，MSC在人体中的临床应用仅限于特定的细胞类型和疾病。相比之下，MSC-EVs复制了若干母细胞特性，有时甚至超越它们，尤其是在免疫和炎症环境中。

与其祖细胞不同，MSC-EVs不具有复制和分化特性。它们在细胞外环境中具有更高的安全性、高效的运输和有效的组织穿透性，这些优势非常显著，尤其是在体内给药方面。MSC-EVs独特的运作机制表明，它们缺乏其亲本细胞的多种结构和功能特性，从而增强了其安全性和治疗潜力（表3）。

MSC-EVs的突破性治疗优势

相较于MSCs，MSC来源EVs（MSC-EVs） 具备革命性优势：

• 安全性：无自我复制/分化能力，规避癌变风险；
• 免疫兼容性：无细胞疗法免疫原性，避免排斥反应；
• 微环境稳定性：不受病变组织微环境影响（如胰腺癌中MSCs会促癌）；
• 递送效率：直径仅100-300nm，可穿透血脑屏障，避免肺毛细血管滞留（MSCs直径15-30μm会致肺部栓塞）。

EVs的临床转化核心价值

特性	MSCs	MSC-EVs
直径	15-30 μm	100-300 nm
体内滞留	肺/肝/脾聚集	全身长效循环
免疫风险	引发排斥反应[54]	几乎无免疫原性
工程化潜力	困难	易基因改造装载药物
靶向修饰	不可行	表面蛋白可定向修饰

临床应用前景与挑战

临床前研究表明MSC-EVs副作用显著低于细胞疗法，但需解决：

标准化定量：尚无统一EVs给药计量标准；

药效评估：需完善药代/药效动力学研究；

工程化优化：改造后EVs虽潜力更大，但需建立标准化制备流程。EVs疗法有望成为下一代无细胞治疗平台。

6、MSC-EVs的组成

异质性来源与尺寸多样性

MSC-EVs的组成异质性源于其尺寸差异（30-2000 nm）及细胞来源特异性：

• 生产机制：多泡体（MVB）膜的不均匀内陷导致囊泡内容物（蛋白质/核酸/液体）分布不均；
• 分离方法：不同分离技术（如超速离心、尺寸排阻色谱）可能混杂其他EV亚型，造成尺寸混杂；
• 亚群存在：先进分馏技术证实，小EVs（含外泌体）内部存在按尺寸定义的亚群（如30-50nm vs. 80-150nm）。

关键影响：尺寸差异直接影响货物载量及靶细胞相互作用效率。

分子组成：膜蛋白与胞质货物

膜相关组分

类别	代表性分子	功能
跨膜蛋白	CD9, CD63, CD81 (TSPAN家族), MHC II复合物	细胞黏附、免疫识别
ESCRT复合物	TSG101, Alix	囊泡出芽与货物分选
信号分子	整合素家族, RAB GTP酶 (RAB4/11/27)	细胞通讯与囊泡运输调控
脂筏标志物	胆固醇, 鞘磷脂, GPI锚定蛋白, Flotillin	维持膜结构稳定性

胞质货物

• 结构蛋白：肌动蛋白（Actin）、微管蛋白（Tubulin）、丝切蛋白（Cofilin）；
• 分子伴侣：热休克蛋白Hsp70/Hsp90；
• 核酸结合蛋白：RNA结合蛋白（RBPs）、核糖核蛋白复合物。

核酸成分：争议与特征

DNA：存在性争议

• 否定观点：基于蛋白质组学分析，外泌体不含双链DNA及组蛋白，细胞外DNA分泌依赖自噬-MVE通路；
• 肯定证据：成像流式细胞术证实外泌体携带双链DNA，核内容物可通过未知机制装载。

RNA：组成与功能瓶颈

RNA类型	平均长度	富集特征	功能限制
miRNA	18-24 nt	MSC-EVs中浓度比母细胞高10倍	单囊泡仅含1.3个pre-miRNA分子
mRNA	100-400 nt	片段化严重	无法翻译全长功能蛋白[66,80-83]
非编码RNA	circRNA, tRNA	选择性富集	调控受体细胞基因表达

miRNA装载机制：

• nSMase2依赖途径
• SUMO化hnRNPs依赖途径
• miRNA 3′序列依赖性途径
• miRISC相关途径

脂质双层结构与动态性

• 厚度：5nm ；
• 核心脂质：胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺、磷脂酰丝氨酸（保守性强，跨细胞类型差异小）；
• 功能关联：脂筏结构（含胆固醇/GPI锚定蛋白）介导靶向运输。

组成影响因素与纯度挑战

动态变量

1. 微环境调控：缺氧/炎症状态改变EVs的蛋白质组（如ECM蛋白、代谢酶）；
2. 分离方法：蛋白酶污染可能导致跨膜蛋白（CD44/CD73/CD90）酶切，形成游离片段污染；
3. 标志物异质性：同一批EVs中特定货物（如miRNA）丰度差异显著，需谨慎选择纯化标志物。

纯度评估标准

• 正向标志物：跨膜蛋白（CD9/CD63/CD81）、MSC表面抗原（CD44/CD73/CD90）；
• 负向标志物：脂蛋白、载脂蛋白（APOA1/2, APOB）、白蛋白（提示肝细胞污染）；
• 建议策略：量化污染物清除效率，而非依赖二元检测。

细胞内源污染物

部分EVs可能携带非典型组分（如线粒体、高尔基体片段），但小EVs（<200 nm）中极少富集。

总结：MSC-EVs的组成是其功能多样性的物质基础，但异质性、动态变化及纯度问题仍是临床转化的核心挑战。未来需结合单囊泡分析技术深化机制研究。

7、MSC-EVs的6种分离方法

EVs的分离方法对后续研究与生产至关重要。目前主要采用以下六种技术：

1. 超速离心法（UC）
2. 密度梯度离心法（DGC）
3. 超滤法
4. 尺寸排阻色谱法（SEC）
5. 聚合物沉淀法
6. 免疫亲和纯化法

下文将概述这些现代分离技术的原理与应用。

根据密度差异，EV可与乳糜微粒、VLDL、IDL 和 LDL 区分开来（表4）；这些颗粒的密度低于EV（<1.063 g/mL）。相反，高密度脂蛋白的密度与 EV 相似（1.06~1.21 g/mL），只能通过尺寸差异与EV分离（参见表2）。分离EV的方法多种多样（表5），每种方法都有其独特的优点和缺点。

粒子类型	尺寸（纳米）	密度（克/毫升）
乳糜微粒	75–1200	<0.95
乳糜微粒残留物	30–80	0.95–1.006
极低密度脂蛋白（VLDL）	30–80	0.95–1.006
中密度脂蛋白（IDL）	23–27	1.006–1.019
低密度脂蛋白（LDL）	18–23	1.019–1.063
高密度脂蛋白（HDL）	7–13	1.063–1.21
细胞外囊泡	30–1000	1.06–1.21

方法	原理	优势	局限性
超速离心法 (UC)	利用高速离心力沉降EVs	可高效沉淀EVs	对小尺寸/低密度颗粒效率低；重复离心降低得率（囊泡损失与结构损伤）
密度梯度离心法 (DGC)	基于浮力密度差异，在蔗糖等梯度介质中分离EVs	可分离密度相近的颗粒	可能共分离密度相似的非EV颗粒；导致EVs损失和损伤
尺寸排阻色谱法 (SEC)	依据分子尺寸分离，大分子EVs先于小分子蛋白洗脱	操作温和，保留囊泡完整性	无法排除非EV物质；洗脱液稀释需额外浓缩步骤；需合并多组分
超滤法	通过膜孔径截留大尺寸EVs	快速、可处理大体积样本	存在外泌体形变风险；小分子流体成分易污染样本
聚合物沉淀法	体积排阻聚合物（如PEG）沉淀EVs及相似尺寸颗粒，低速离心收集	操作简单，适合临床转化	蛋白去除率低，存在蛋白污染风险
免疫亲和纯化法	抗体靶向捕获特定表面标志物（如CD63）的EV亚群	特异性与纯度高	耗时长、成本高（需延长抗原-抗体结合时间）；试剂质量要求严格；仅获特定EV亚群

8、细胞外囊泡的存储

储存条件对于维持MSC条件培养基中EV的特性至关重要，包括其稳定性、颗粒数、聚集性和功能性。对于MSC条件培养基和分离的EV，提供其储存方式的具体细节（包括所用容器类型、储存温度和储存时间）至关重要。在储存过程中，主要问题之一是高纯度EV的损失，这可能是由于它们粘附在储存容器表面造成的。

目前，−80°C被认为是MSC条件培养基和分离的EV的最佳储存温度。然而，一些研究表明，在此温度下储存会导致EV特性随时间发生变化。无论使用防腐剂还是冷冻保护剂，在−80°C下储存均已证实会降低EV浓度和纯度，并改变粒度和zeta电位。此外，建议避免反复冻融循环，因为这会对EV质量产生潜在的有害影响。

9、结论

EV分类学的演变与挑战

历史上，EVs 被称为不同囊泡的组合，包括外泌体（小型 EVs）、微囊泡（大型 EVs）和外泌体（小型/大型 EVs）。早期研究经常互换使用这些术语。然而，最近的进展使得这些 EVs 之间的区别更加清晰，关注的是它们的物理特性，而不仅仅是它们的生物发生机制。虽然基于大小的分类很实用，但它并不总是能准确区分 EVs 的类型，例如微囊泡和外泌体。迄今为止，创新技术能够在复杂混合物中识别和表征 EVs 亚型。为了准确分类，这种方法需要考虑多种特征，包括表面标志和大小，强调详细特征而不是简单的测量指标，例如大小。

胞外囊泡（EV）是细胞间运输关键物质（蛋白质、RNA、脂质和碳水化合物）的重要信使，其成分主要与来源细胞相似。越来越多的研究表明，MSC-EV 具有与 MSC 类似的功能，参与 MSC 的旁分泌信号传导，可能有助于其他干细胞的进展和分化，促进组织再生，并发挥免疫调节作用。

MSC-EVs的治疗优势与产业化瓶颈

与目前的细胞方法相比，MSC-EVs更易于管理、更具成本效益，且易于大规模生产。然而，其作为一种更优的临床治疗策略的发展受到诸多挑战的阻碍。MSC-EVs在体外和体内研究中的标准化应用仍然不足，阻碍了临床试验的开展。不同研究方法的不一致影响了可比性，需要建立可重复的EVs纯化和表征技术。

治疗属性	产业化挑战
继承MSCs旁分泌功能：促进干细胞分化、组织再生与免疫调节	标准化缺失：分离/表征方法不统一阻碍临床试验
无细胞治疗优势：易储存运输、无免疫排斥、无伦理争议	规模化生产瓶颈：缺乏符合GMP标准的量产工艺
工程化潜力：可修饰增强靶向性	药效学盲区：靶向机制与药代动力学不明

临床转化路径与未来方向

MSC-EVs作为治疗手段的应用与MSCs大规模培养和临床应用的进展密切相关，展现出巨大的治疗前景。MSC-EVs 具有诸多优势，包括易于储存和运输、保质期更长、免疫排斥风险更低以及比细胞疗法更少的伦理问题。然而，其临床应用仍需解决几个关键问题，包括开发大规模生产方法、实现精准定量和表征、了解其药代动力学和靶向机制以及全面评估其安全性。

未来的关键方向之一是标准化和可扩展的EVs生产工艺，以优化功能和储存条件。此外，提高EVs的分离效率和选择性也至关重要。TFF已成为一种备受青睐的首选方法，与免疫沉淀和密度梯度离心 (UC) 等传统技术相比，它具有可扩展性和可靠性。进一步的研究还将探讨环境条件和工程设计如何影响MSC-EVs的功能，从而增强其在再生医学中的治疗效果。尽管MSC-EV疗法具有巨大的潜力，但扩大GMP级EV药物的生产和开展全面的临床试验仍然面临重大挑战。

参考资料：[1]Huang, CY. (2025). Biology of Extracellular Vesicles from Mesenchymal Stem Cells. In: Liem, N.T., Forsyth, N.R., Heke, M. (eds) Cell Therapy. Springer, Singapore. https://doi.org/10.1007/978-981-96-1261-1_6

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